樊帥, 劉坤, 金媛媛, 楊兆勇

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所, 北京 100050

D-對(duì)羥基苯甘氨酸是一種重要的精細(xì)化工品，廣泛應(yīng)用于藥學(xué)領(lǐng)域。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素類(lèi)藥物(如阿莫西林、頭孢拉定和頭孢立新等)的側(cè)鏈化合物、肽激素和擬除蟲(chóng)菊酯的合成都需要D-對(duì)羥基苯甘氨酸[1]，并可以用作磷和硅的分析試劑。目前D-對(duì)羥基苯甘氨酸采用酶法制備，即由D-海因酶和D-氨甲酰水解酶偶聯(lián)酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸[2](圖1)，該方法具有環(huán)境友好、底物轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物光學(xué)活性單一和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。D-海因酶(D-hydantoinase，EC 3.5.2.2,HYD)作為酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的關(guān)鍵酶，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和植物中。HYD能特異性地將D-單替代海因水解為N-氨甲?；?D-氨基酸，而L-單替代海因在堿性條件下消旋轉(zhuǎn)化為D-單替代海因，進(jìn)而使得HYD能夠?qū),L-單替代海因 100 %轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的N-氨甲酰-D-氨基酸。

圖1 D-海因酶和氨甲?；饷复呋^(guò)程

D-海因酶主要來(lái)源于微生物，如Burkholderiapickettii[3]、Bacillusstearothermophilus[4]、Pseudomonasfluorescens[5]和Pseudomonasputida[6]等，不同來(lái)源的HYD最適反應(yīng)溫度一般為30～60 ℃，耐熱性較差，限制了其在工業(yè)酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸中的應(yīng)用。現(xiàn)階段，針對(duì)D-海因酶活性和耐熱性較差的缺點(diǎn)，不同研究者利用不同方法對(duì)D-海因酶進(jìn)行改造。Chern 等[7]對(duì)源于BacilluscirculansHYD的C-末端連入幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，利用幾丁質(zhì)固定化重組HYD，將其45 ℃ 的半衰期延長(zhǎng)至270 h；Kim等[8]構(gòu)建了D-海因酶和D-氨甲酰水解酶的融合酶，并利用定向進(jìn)化篩選獲得活性提高的突變體；Aganyants 等[2]通過(guò)對(duì)底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸Phe159和Trp287突變，改變了來(lái)源于BacillusstearothermophilusHYD的底物特異性。

來(lái)自Bacillussp.AR9的HYD[9]熱穩(wěn)定性突出，最適反應(yīng)溫度為65 ℃，在70 ℃下的半衰期為80 min，且最適pH為9.0，能夠滿足海因酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的需要，具有工業(yè)化生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的應(yīng)用潛力。為了解決D-海因酶的工業(yè)化應(yīng)用中存在活性較低和穩(wěn)定性較差的問(wèn)題，從而獲得高催化活性和高穩(wěn)定性的D-海因酶，本研究通過(guò)研究來(lái)源于Bacillussp.AR9的D-海因酶空間結(jié)構(gòu)，分析其底物通道，對(duì)底物通道瓶頸的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，結(jié)合高通量篩選方法，最終獲得活性提高的突變體，為該酶應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

表達(dá)HYD蛋白的hyd基因(PDB登錄號(hào)：4KIR)由華大基因公司合成，并對(duì)其密碼子優(yōu)化使其適于大腸桿菌表達(dá)。表達(dá)菌株BL21(DE3)購(gòu)自Novagen，表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(+)購(gòu)自Novagen，對(duì)羥基苯海因購(gòu)自Sigma，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 突變文庫(kù)的構(gòu)建與篩選

采用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2(諾維贊)試劑盒進(jìn)行點(diǎn)飽和突變文庫(kù)的構(gòu)建，點(diǎn)飽和突變引物如表1所示。每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)挑取190個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，具體步驟如下：將轉(zhuǎn)化子接種到每孔含200 μL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg·mL-1的氨芐西林，Amp)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃條件下200 r·min-1搖床培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到1.0，向每個(gè)孔中加入IPTG(終濃度0.2 mmol·L-1)，在18 ℃下誘導(dǎo)12 h。將培養(yǎng)物添加溶菌酶處理(終濃度 1 mg·mL-1)30 min并反復(fù)凍融2次(-80 ℃，15 min；37 ℃，15 min)，然后在4 000 r·min-1下離心10 min去除沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中，添加1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))對(duì)羥基苯海因在37℃反應(yīng)30 min，最終加入等體積的 10%對(duì)二甲氨基苯甲醛(溶于6 mol·L-1鹽酸)進(jìn)行顯色反應(yīng)，在430 nm下測(cè)定吸光度，數(shù)值越高代表活性越高。

表1 飽和突變引物

1.3 HYD和突變體的表達(dá)與純化

將HYD和突變體的表達(dá)菌株接種在LB培養(yǎng)基(Amp終濃度為100 μg·mL-1)，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)到OD600值為0.6～0.8，然后加入終濃度為0.2 mmol·L-1IPTG，18 ℃，200 r·min-1誘導(dǎo)過(guò)夜。將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物4 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，收集菌體用Lysis buffer(20 mmol·L-1磷酸緩沖液，500 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑，pH 7.4)重懸，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎后，18 000 r·min-1，4 ℃離心30 min，收集上清。pET-21a(+)帶有His6標(biāo)簽，因此選用Ni-NTA Agarose(Qiagen)來(lái)進(jìn)行第一步純化，純化過(guò)程如下：將破碎上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾，然后注入經(jīng)Lysis buffer平衡的親合層析住，并將濾出液重復(fù)上樣一次；隨后用Washing buffer(20 mmol·L-1磷酸緩沖液，500 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1咪唑，pH 7.4)5倍柱體積沖洗，最后用Elution buffer(20 mmol·L-1磷酸緩沖液，500 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1咪唑，pH 7.4)洗脫目的蛋白。隨后將洗脫的蛋白在30 K超濾濃縮管(Millipore)進(jìn)行脫鹽濃縮，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，選取有單一目的條帶的蛋白超濾濃縮后以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 酶活性的測(cè)定

D-海因酶反應(yīng)體系如下：5 mmol·L-1對(duì)羥基苯海因，20 mmol·L-1Tris(pH 8.0)，100 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1ZnCl2，反應(yīng)時(shí)間10 min，反應(yīng)結(jié)束用10%三氟乙酸終止反應(yīng)，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后利用高效液相色譜儀(Agilent technologies 1200 series, USA)進(jìn)行測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物D-對(duì)羥基苯甘氨酸的含量。所用色譜柱為：Hypersil GOLD C8(250 mm × 4.6 mm)色譜柱；流動(dòng)相為水∶甲醇∶三氟乙酸=95∶5∶0.01(體積比)，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm。酶活力定義：1 min內(nèi)催化底物生成1 μmol N-氨甲酰氨基酸所需的酶量為一個(gè)活力單位(U)。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

1.5.1最適反應(yīng)溫度的測(cè)定將D-海因酶在不同溫度(40、50、60、65、70和80 ℃)，pH 8.0的條件下測(cè)定酶活性，將最高活力定為100%。

1.5.2最適反應(yīng)pH的測(cè)定在不同pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)，50 ℃下測(cè)定D-海因酶的活性，將最高活力定為100%。

1.5.3米氏常數(shù)Km的測(cè)定不同濃度對(duì)羥基苯海因(0.2、0.5、1.0、3.0、7.0、10.0和30 mmol·L-1)，20 mmol·L-1Tris(pH 8.0)、100 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1ZnCl2為底物，分別加入適量的D-海因酶，50 ℃，反應(yīng)10 min，測(cè)定D-海因酶在不同底物濃度反應(yīng)體系中的活性，通過(guò)軟件GraphPad Prism v5.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)中Michaelis-Menten方程以計(jì)算酶反應(yīng)的Vmax和Km。

1.5.4催化常數(shù)kcat值的測(cè)定已知酶濃度，根據(jù)測(cè)得的Vmax值以及公式1-1計(jì)算kcat值。

Vmax=kcat[E]

(1)

式中,[E]代表酶的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HYD定點(diǎn)飽和突變

來(lái)源于Bacillussp.AR9的HYD晶體結(jié)構(gòu)已被報(bào)道[9]，利用Caver軟件(http://www.caver.cz/)對(duì)HYD底物通道進(jìn)行模擬分析，結(jié)果如圖2所示，通道長(zhǎng)度10.0 ?，主要由M63、P64、P65、F92、L94、F152、Y155、V158、F159、V238、S288、P289、C317、F319和I335組成，瓶頸氨基酸殘基為M63、F65、G66、V158和F159。由于組成底物通道的部分氨基酸保守且與底物有潛在的相互作用，改變這部分氨基酸不利于反應(yīng)的進(jìn)行，而底物通道瓶頸處的氨基酸的改變可能有利于催化的發(fā)生，故針對(duì)底物通道瓶頸氨基酸構(gòu)建點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，配合96孔板篩選，獲得了活性提高的突變體。

A：HYD催化氨基酸和底物通道瓶頸氨基酸；B：HYD蛋白表面結(jié)構(gòu)。粉色：Met63；藍(lán)色：Phe65；淺藍(lán)色：Gly66；黃色：Val158；紅色：Phe159；綠色：催化氨基酸殘基(His58，His60，Lys150，His183，His239和Asp315)

在本研究中，對(duì)M63、F65、G66、V158和F159 5個(gè)位點(diǎn)作為突變位點(diǎn)，通過(guò)兼并引物在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上引入突變，從而構(gòu)建單位點(diǎn)的飽和突變文庫(kù)。HYD催化產(chǎn)物N-氨甲酰氨基酸可以與顯色劑對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，由此可通過(guò)96孔板來(lái)篩選高活性的HYD突變體，最終通過(guò)對(duì)M63、F65、G66、V158和F159 5個(gè)位點(diǎn)的篩選和測(cè)序確定活性提高的突變體如圖3所示，與野生型HYD(來(lái)源于Bacillussp.AR9)相比，突變體表現(xiàn)出更好的活性，其中突變體F159S、F159A和F65V的活性相較于野生型HYD分別提高了51%、40%和17%。

圖3 點(diǎn)飽和文庫(kù)篩選結(jié)果

2.2 HYD及其突變體的表達(dá)與純化

為了進(jìn)一步研究HYD及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)，以F159S為基礎(chǔ)通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建了雙位點(diǎn)突變體F65V/F159S，對(duì)野生型HYD、F65V、F159S和F65V/F159S進(jìn)行了鎳柱純化，純化結(jié)果如圖4所示。目的蛋白大小位于50 kD位置處，與預(yù)期相符，并且目的蛋白純度在90%以上。

M：Marker；1：HYD(WT)；2：F65V；3：F159S；4：F65V/F159S

2.3 HYD及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究

對(duì)HYD及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，野生型HYD的最適溫度為65 ℃，最適pH為9.0，突變體與野生型HYD相比，沒(méi)有明顯的變化。

A：溫度對(duì)酶活性的影響；B：pH對(duì)酶活性的影響

2.4 HYD及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究

以對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜?，?duì)野生型HYD及其突變體的酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2顯示，野生型HYD的Km為7.5 mmol·L-1，kcat為23 s-1，而突變體與野生HYD型相比，Km未有較大的變化，表明突變體與野生型HYD對(duì)底物的親和力近似。對(duì)于kcat值，F(xiàn)65V、F159S和F65V/F159S是野生型HYD的1.3、1.9和2.0倍，最終雙位點(diǎn)突變F65V/F159S的催化效率kcat/Km是野生型HYD的2.4倍。

表2 HYD(WT)及突變體催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)

2.5 HYD和突變體F65V/F159S結(jié)構(gòu)分析

以HYD的晶體結(jié)構(gòu)為模型，對(duì)突變體F65V/F159S三維結(jié)構(gòu)建模，并對(duì)兩者的底物通道進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，在野生型HYD中，F(xiàn)65與F159位于底物通道的兩側(cè)，由于苯丙氨酸較大的側(cè)鏈限制了底物通道出口的大小，F(xiàn)65與F159之間的最小距離為7.5 ?，而突變體F65V/F159S中，突變后V65和S159同樣位于底物通道出口處，且V65和S159之間的最小距離為11.8 ?，由此可知突變體F65V/F159S通過(guò)在兩個(gè)位置上引入側(cè)鏈體積更小的氨基酸，擴(kuò)大了底物通道瓶頸處的距離。

A：HYD底物通道；B：突變體F65V/F159S底物通道

3 討論

酶法制備D-氨基酸，由于其經(jīng)濟(jì)性、高效性和環(huán)保性而被廣泛用于光學(xué)純D-氨基酸的合成，目前酶法制備的D-氨基酸年產(chǎn)量可達(dá)幾千噸[10-11]，市場(chǎng)前景廣闊。D-海因酶和D-氨甲酰水解酶偶聯(lián)酶催化合成D-氨基酸工藝已有報(bào)道。D-海因酶的主要底物為D-苯甘氨酸[12]和D-對(duì)羥基苯甘氨酸[13-14]，也可用于生產(chǎn)D-纈氨酸、D-丙氨酸和D-色氨酸等其他D-氨基酸[15-17]。現(xiàn)階段D-海因酶作為一種具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的生物酶催化劑，可極大加速化學(xué)反應(yīng)且還擁有高度的區(qū)域和立體選擇性，但該酶對(duì)溫度的耐受性不高且仍需提高反應(yīng)速度。通過(guò)人工模擬自然進(jìn)化的過(guò)程，可加速D-海因酶的進(jìn)化過(guò)程，但由于定向進(jìn)化需要篩選大量突變體且有效陽(yáng)性突變率非常低，近十年科學(xué)家發(fā)展了多種方法來(lái)設(shè)計(jì)庫(kù)容小但質(zhì)量高的突變體文庫(kù)，從而簡(jiǎn)化篩選的過(guò)程。應(yīng)用Caver軟件[18]分析底物通道，找出底物進(jìn)出口的瓶頸氨基酸作為目標(biāo)氨基酸，然后進(jìn)行定點(diǎn)突變，這種策略可減少突變體文庫(kù)的數(shù)量并提高篩選效率。該方法被廣泛應(yīng)用于多種酶活性、穩(wěn)定性提高和選擇性改造[19-21]。本文通過(guò)對(duì)來(lái)源于Bacillussp.AR9的D-海因酶HYD底物通道的分析，找到底物通道瓶頸處的5個(gè)氨基酸(M63、F65、G66、V158和F159)，對(duì)這5個(gè)位置的氨基酸應(yīng)用飽和突變構(gòu)建單點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，輔以96孔板篩選手段篩選高活性突變體，并對(duì)活性較高的突變體進(jìn)行了組合，最終雙位點(diǎn)突變體F65V/F159S的催化效率是野生型HYD的2.4倍。分析野生型HYD和突變體F65V/F159S底物通道，在野生型HYD中，F(xiàn)65與F159之間的最小距離為7.5 ?，而突變體F65V/F159S中V65和S159之間的最小距離為11.8 ?，突變體F65V/F159S通過(guò)在兩個(gè)位置上引入側(cè)鏈體積更小的氨基酸，擴(kuò)大了底物通道瓶頸處的距離，加快了底物進(jìn)出的速度，這與突變體kcat數(shù)值的提高相符，由此可以看出通過(guò)Caver找尋底物通道瓶頸處的氨基酸，設(shè)計(jì)飽和突變文庫(kù)篩選高活性的突變體是一個(gè)成功的策略，可在海因酶家族乃至整個(gè)酶進(jìn)化中應(yīng)用。