陶紅平, 張覓, 游長江, 戈惠, 劉洋, 鄭先念

1.武漢市第五醫(yī)院, 急診科，武漢 430050；2.武漢市第五醫(yī)院, 骨科，武漢 430050

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是一種常見的運動系統(tǒng)退行性疾病,可能在受傷后發(fā)生，是導致慢性腰背部疼痛的主要原因，嚴重影響了全球約540萬人的生活質量，對家庭和社會造成極大的影響[1]。自1999年以來，慢性背痛的發(fā)生率增加了54%[2]。椎間盤作為連接上下椎體的軟骨樣組織，其主要作用是傳遞和吸收作用在脊柱軸向的壓縮應力、緩沖震動并增大脊柱的運動幅度，因此，是人體中較早發(fā)生退行性改變的組織。正常椎間盤由纖維環(huán)(AF)和髓核(NP)組織組成，營養(yǎng)物質通過軟骨終板(CEP)擴散到椎間盤。AF主要由成纖維細胞樣纖維環(huán)細胞和相互交聯(lián)的Ⅰ型成纖維細胞組成。NP主要由富含Ⅱ型膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)組成，它的作用是抵消和傳遞軸向壓力載荷。AF中的纖維結構圍繞著凝膠狀的NP，以維持椎間盤的彈性和機械強度[3]。在正常椎間盤中，許多生長因子和細胞因子使ECM的合成和分解保持動態(tài)平衡[4]。雖然椎間盤退行性改變是多因素作用的結果，但是損傷是其中一個很重要的因素[5]。椎間盤退變過程中可以看到椎間盤膠原纖維的變化以及細胞外基質變化如糖胺聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質素、透明質酸。纖維化是許多慢性非傳染性疾病中發(fā)生的基本病理變化，并且是許多慢性疾病中組織器官功能下降甚至喪失的主要原因。纖維化幾乎影響人體的所有系統(tǒng)和器官[6]。過度的纖維化會導致纖維結締組織增多，實質細胞減少，從而導致器官結構破壞甚至功能衰竭。椎間盤細胞再生能力有限，輕微損傷的椎間盤主要以纖維化瘢痕修復為主。在這個過程中，大量成纖維細胞聚集在椎間盤組織中，改變了膠原纖維、細胞外基質的成分造成進一步的椎間盤退變；另一方面，成纖維細胞釋放炎癥因子也加速了椎間盤的退變過程[7]。因此減輕椎間盤纖維化的過程從某種程度上會減緩椎間盤的退行性改變。

組織發(fā)生纖維化過程往往與免疫效應細胞及其釋放的細胞因子密切相關，其中IL-13是調(diào)節(jié)纖維化最重要的Th2細胞因子之一[8]。IL-13通過與IL-13受體結合發(fā)揮生物學作用，其中在IL-13信號通路中起關鍵作用的是可溶性IL-13Rα2(sIL-13Rα2)[9]。IL-13與成纖維細胞表面的IL-13Rα1受體復合物結合，導致信號轉導子和轉錄激活子6(STAT6)的磷酸化。磷酸化的STAT6能夠促進纖維化過程[10]。有研究表明在纖維化組織中，IL-13濃度較高，造成組織退變細胞外基質如Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白多糖等的沉積改變[11]。因此，我們推斷，給予IL-13細胞因子高效拮抗劑可能通過調(diào)控椎間盤纖維化過程減慢椎間盤損傷的退變過程。本研究通過給予不同濃度IL-13抑制劑sIL-13Rα2-Fc，并觀察椎間盤病理變化，以期研究IL-13對椎間盤退變的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物清潔級SD雄性大鼠50只，8～10周齡，體重為250～300 g，購自湖北省疾控中心，許可證號：SCXK20199-0006(鄂)。常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由取食和飲水。實驗符合動物倫理學要求，實驗方案得到武漢市第五醫(yī)院倫理委員會認可與批準。

1.1.2試劑PCR引物由武漢光谷生物工程有限公司合成。CollagenⅡ(批號sc-52658)、Aggrecan抗體(批號sc-166951)購于美國 Santa Cruz公司。β-actin抗體(批號ab8226)購于英國Abcam公司。sIL-13Rα2-Fc蛋白、核酸提取劑Trizol購于湖北天鷹生物科技有限責任公司；PCR試劑盒、Masson藍化液、Weigert鐵蘇木素染色液、蘇木素染色液、伊紅染色液購于武漢麗華科技有限責任公司?？鼓z原蛋白Ⅰ抗體、抗膠原蛋白Ⅱ抗體、抗β-肌動蛋白抗體購于武漢光谷生物工程有限公司。

1.1.3設備光學顯微鏡購于北京生物科技公司，石蠟組織切片機購于湖南榮和科技公司，高速離心機購于上海佳德儀器公司，凈化工作臺購于蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司，偏振光顯微鏡購于武漢光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠尾椎間盤退變模型在實驗開始前，所有大鼠在動物房適應性飼養(yǎng)3 d，常規(guī)單獨飼養(yǎng)，自由進食、飲水。大鼠隨機編號分為5組，每組10只：空白組、模型組、sIL-13Rα2-Fc蛋白低劑量干預組、sIL-13Rα2-Fc蛋白中劑量干預組和sIL-13Rα2-Fc蛋白高劑量干預組?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不作特殊處理；其余各組通過針刺法對椎間盤進行穿刺建立模型。具體的穿刺方法如下：腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。麻醉成功后，將大鼠采取俯臥位固定于操作臺上，碘伏消毒鋪巾。選擇Co7/8、Co8/9、Co9/10 椎間隙按照Chia-Hsian等[12]的方法，選用20 G的注射針頭進行纖維環(huán)穿刺。造模完成后第7日開始以造模路徑分別注射不同濃度的sIL-13Rα2-Fc蛋白(低劑量組 1 mg·kg-1、中劑量組 1.5 mg·kg-1、高劑量組 2 mg·kg-1)和等劑量生理鹽水(模型組)。在藥物干預后第4周每組處死5只大鼠，第6周再每組處死5只大鼠。取出Co7/8、Co8/9、Co9/10椎間盤及其臨近椎體，將其放入10%甲醛溶液浸泡固定。

1.2.2組織學染色HE染色：椎間盤常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片。伊紅染色3 min,棄去，乙醇梯度脫水、二甲苯脫蠟、中性樹膠封片。封片后倒置顯微鏡觀察。Masson染色：蠟塊切片脫蠟至水蘇木精染色1 min,磷鉬酸分色液分化，苯胺藍染色5 min，無水乙醇沖洗，吹干后中性樹膠封片。封片后倒置顯微鏡觀察。根據(jù)組織學分類的主要子類別對組織切片進行分級(表1)。

表1 椎間盤染色的組織學分級標準

1.2.3椎間盤糖胺多糖、硫酸軟骨素、硫酸角質素、透明質酸含量測定第4、6周取大鼠全層椎間盤放入EP管中，加入木瓜蛋白酶消化液，消化36 h。各組采用DMMB比色法定量檢測試劑盒測定，計算測定結果。

1.2.4Ⅰ型膠原蛋白及Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達水平檢測利用 Trizol 法提取組織總RNA。使用微量分光光度計在A260/A280處測量RNA含量。分別根據(jù)QuantiNova逆轉錄試劑盒說明依次進行逆轉錄和PCR擴增。以GAPDH為內(nèi)參，按照說明書行實時定量PCR檢測。每組實驗均重復3次。具體引物序列見表2。

表2 RT-PCR相關基因的引物序列

1.2.5蛋白質印跡分析取椎間盤組織，研磨棒充分研磨。RIPA緩沖液裂解細胞，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離含蛋白質樣品，并電泳轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用在Tris緩沖鹽水中稀釋的5%脫脂牛奶將膜封閉。漂洗后分別與抗CollagenⅠ(1∶800)、抗CollagenⅡ(1∶800)、β-actin(1∶1 000)等抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后, 再加入二抗繼續(xù)室溫孵育1 h。采用Image Pro Plus 軟件通過光密度測定法對條帶進行分析。

1.2.6統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件進行分析實驗數(shù)據(jù), 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示, 使用單因素方差分析進行多個組之間的比較。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 sIL-13Rα2-Fc對大鼠尾椎間盤組織形態(tài)的影響

在sIL-13Rα2-Fc干預的第4和6周對大鼠椎間盤組織進行染色分析(圖1～3)。從切片可見，模型組和sIL-13Rα2-Fc蛋白干預組的椎間盤組織中的NP細胞數(shù)量減少，AF的排列紊亂并破裂，說明纖維環(huán)穿刺法造模成功，模型組及干預組均出現(xiàn)不同程度椎間盤退行性改變。sIL-13Rα2-Fc蛋白干預4周后，與模型組相比，sIL-13Rα2-Fc蛋白干預組的椎間盤退變有所緩解，AF和NP之間的連接處變寬。干預6周后，模型組椎間盤AF的排列更加紊亂，破裂部位擴大，NP細胞數(shù)量明顯減少。與模型組相比，sIL-13Rα2-Fc顯著減緩了大鼠椎間盤髓核和纖維環(huán)退變，其特征在于纖維環(huán)排列規(guī)則，破裂部位的減小和NP細胞數(shù)量的增加。說明IL-13抑制劑sIL-13Rα2-Fc干預能夠不同程度改善椎間盤退變。各實驗組sIL-13Rα2-Fc干預的第4周和第6周的椎間盤總評分見表3和表4。

表3 IL-13抑制劑干預4周后椎間盤評分

表4 IL-13抑制劑干預6周后椎間盤評分

圖1 椎間盤纖維環(huán)HE染色(×40)

2.2 IL-13抑制劑對大鼠尾椎間盤組織糖胺多糖(GAG)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質素(KS)、透明質酸(HA)含量的影響

干預第4周，模型組的GAG和HA含量(P<0.05)及CS/KS比(P<0.05)低于空白組。與模型組相比，低劑量干預組的GAG和HA含量、CS/KS無差異(P>0.05)，而中、高干預組的GAG和HA含量增加(P<0.05)，CS/KS比顯著增加。與模型組相比，中、高干預組中的GAG和HA含量隨時間增加(P<0.05)，CS/KS比緩慢降低且呈現(xiàn)濃度依賴性。這些結果表明椎間盤退變可導致細胞外基質成分改變，糖胺多糖、硫酸軟骨素、硫酸角質素、透明質酸含量下降，而sIL-13Rα2-Fc干預可明顯增加糖胺多糖、硫酸軟骨素、硫酸角質素、透明質酸含量(圖4)。

圖2 椎間盤髓核HE染色(×40)

圖3 大鼠椎間盤Masson染色

注：*表示與空白組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。#表示與模型組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。

2.3 IL-13抑制劑對大鼠尾椎間盤組織Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達的影響

干預第4周，模型組和干預組的Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達水平高于空白組(P<0.05)，Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達水平低于空白組(P<0.05)。在干預第6周，隨著干預時間的延長，Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達水平降低(P<0.05)，Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達水平增加(P<0.05)，呈濃度依賴性(圖5)。RT-PCR結果表明sIL-13Rα2-Fc干預能夠減少Ⅰ型膠原蛋白的水平，并增加Ⅱ型膠原蛋白水平，減輕椎間盤退行性改變并呈時間濃度依賴性。

注：*表示與空白組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。#分別表示與模型組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。

2.4 Western blot分析IL-13抑制劑對大鼠尾椎間盤組織中Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，干預第4周，模型組和干預組的Ⅰ型膠原蛋白水平高于空白組(P<0.05)，Ⅱ型膠原蛋白水平低于空白組(P<0.05)。與干預第4周相比，干預第6周Ⅰ型膠原蛋白水平降低(P<0.05)，Ⅱ型膠原蛋白水平增加(P<0.05)，呈濃度依賴性(圖6～7)。上述結果表明sIL-13Rα2-Fc干預能夠減少Ⅰ型膠原蛋白的水平，并增加Ⅱ型膠原蛋白水平，減輕椎間盤退行性改變，并呈時間濃度依賴性。

注：*表示與空白組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。#表示與模型組相比較，在P<0.05水平有統(tǒng)計學差異。

3 討論

椎間盤退行性疾病是臨床上的常見疾病。其治療方式包括藥物治療、物理治療及手術治療，但長期療效并不令人滿意。椎間盤退行性變可能與損傷、年齡、感染、遺傳等因素相關。在椎間盤的退變過程中會發(fā)生椎間盤細胞的代謝異常，如可降解酶的過度表達、炎性因子的上調(diào)、健康細胞的丟失，以及細胞外基質合成的減少等[13]。椎間盤組織的結構改變是椎間盤功能受損的標志，包括髓核細胞的凋亡增加、髓核細胞數(shù)量減少、細胞內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白含量和水分子含量顯著低于正常的髓核細胞[14]。這些結構變化通過物理和生物學手段很容易檢測出來。研究表明針刺法建立椎間盤退變模型可以在形態(tài)和生物化學上顯示與人類椎間盤退變相類似的特征[15]。尾椎間盤針刺操作簡單，對周圍組織干擾少，可重復性高，且嚙齒類動物的尾椎間盤很容易引起退變，可以作為椎間盤退變修復研究模型[16]，因此本研究采用大鼠尾椎間盤針刺法建模作為人類椎間盤退變的模型[17]。

圖7 椎間盤組織中Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白的Western blot分析

IL-13是一類重要的細胞因子，其受體復合物由至少3個不同的成分組成，包括IL-4受體、低親和力結合鏈IL-13R1和高親和力結合鏈IL-13R2[18]。例如，競爭性抑制IL-13Rα1與IL-13的結合會導致IL-13介導的IL-13/JAK/STAT6信號通路的阻斷，異常膠原蛋白分泌和表達的抑制以及細胞外基質的變化和沉積的減少，從而減少組織損傷。IL-13R2-Fc是一種融合蛋白，它與IL-13結合后可有效阻斷相關的細胞信號傳導途徑，因此可作為IL-13的高親和力拮抗劑[18]，用于在體外和體內(nèi)中和IL-13[20]。Belperio等[21]研究表明，sIL-13Rα2融合蛋白下調(diào)了血吸蟲病患者外周血單個核細胞培養(yǎng)基中的IL-13含量，并減少了組織纖維化。Lumsden等[22]研究表明在肺纖維化中sIL-13Rα2的過表達抑制了IL-13和膠原蛋白的表達，從而發(fā)揮了抗纖維化作用。而IL-13R2-Fc在椎間盤纖維化過程中的作用還缺乏相關的研究。在本研究中，我們進行了HE和Masson染色以評估大鼠椎間盤組織的病理變化。結果顯示，與空白組相比，模型組的椎間盤組織受損程度不同，具體表現(xiàn)為纖維環(huán)破裂、排列紊亂、髓核細胞數(shù)量減少以及纖維環(huán)和髓核之間的邊界模糊，椎間盤評分高。在sIL-13Rα2-Fc干預后，椎間盤組織纖維環(huán)破壞減少、細胞排列整齊、椎間盤評分減低，表明sIL-13Rα2-Fc可一定程度緩解椎間盤退變相關的病理變化。

組織纖維化是椎間盤退變的重要機制，主要表現(xiàn)為大量成纖維細胞的堆積、ECM沉積、炎癥反應和組織結構破壞。研究表明，組織纖維化的發(fā)展和進程受多種因素影響，主要是膠原蛋白和ECM的合成和降解之間的不平衡，導致ECM組成和含量發(fā)生變化。椎間盤的ECM成分主要由膠原蛋白和蛋白聚糖組成。椎間盤疾病發(fā)生后，蛋白聚糖含量降低，蛋白聚糖通過基質降解酶的作用被片段化，組織中滲出小片段，使椎間盤的滲透壓降低并削弱了其保濕作用[23]，可導致椎間盤生物力學功能下降甚至喪失，從而引起一系列臨床癥狀[24-25]。GAG、CS、KS、HA與蛋白聚糖相關，其含量變化一定程度上可模擬退變椎間盤的ECM變化，可作為評估椎間盤退變的指標[26]。在本研究中，我們定量檢測了GAG、CS、KS、HA，發(fā)現(xiàn)退化的椎間盤組織中其含量均有不同程度的降低，而給予sIL-13Rα2-Fc干預后，GAG、CS、KS、HA含量增加，表明sIL-13Rα2-Fc具有減輕椎間盤退變的治療作用。

膠原蛋白是椎間盤的主要ECM成分，Ⅰ型和Ⅱ型膠原約占椎間盤膠原的70%[32]，在生理狀態(tài)下Ⅱ型膠原纖維比Ⅰ型原纖維含水量多 40%～90%[27-28]。在椎間盤退變過程中，組織中的膠原蛋白總量沒有明顯變化，但是膠原蛋白組成有一定的變化：Ⅰ型膠原含量不斷增加，Ⅱ型膠原蛋白含量進一步減少，從而改變了椎間盤的生理特征和生物力學，使其無法發(fā)揮正常的生理功能。周旭等研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變和纖維化期間Ⅰ型膠原蛋白的合成增加，而Ⅱ型膠原蛋白發(fā)生變性，二者比例發(fā)生了失衡[29-30]。在本研究中將sIL-13Rα2-Fc注射入大鼠椎間盤損傷部位，并使用RT-PCR檢測Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達的變化，結果表明sIL-13Rα2-Fc干預可減少椎間盤組織中Ⅰ型膠原mRNA的表達并增加Ⅱ型膠原mRNA的表達，差異存在統(tǒng)計學意義。同時，Western blot結果顯示，IL-13Rα2-Fc干預增加了Ⅱ型膠原蛋白水平，降低了Ⅰ型膠原蛋白的水平，并呈時間濃度依賴性。表明sIL-13Rα2-Fc能夠增加Ⅱ型膠原蛋白，降低Ⅰ型膠原蛋白，可減緩椎間盤退行性變，濃度越高,時間越長,治療效果越好。

綜上所述，IL-13抑制劑sIL-13Rα2-Fc對椎間盤退行性變進行干預，可以有效增加椎間盤細胞外基質含量和Ⅱ型膠原蛋白含量，減輕椎間盤組織纖維化，減輕組織結構損傷，對椎間盤退變有一定的治療作用。此研究也存在一定的局限性：基于針刺法損傷建立的大鼠椎間盤退行性變化的模型。然而人類椎間盤退行性改變是復雜的病理生理過程，本造模方法也不能完美地復制這種臨床人體病理變化，在選擇合適的動物和造模方法時，還應不斷優(yōu)化使之更加接近人類椎間盤退變的自然演進進程。另外本次研究只證明了白介素13信號通路與大鼠椎間盤退變的關系及其作用，后續(xù)將在分子水平對sIL-13Rα2-Fc對椎間盤退行性變的作用機制進行研究。