李翠，錢慧珍，楊美嬌，李聰，張君

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院大連醫(yī)院病理科，遼寧 大連330000）

T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1（Tiam1）是一種在正常人腦組織和睪丸中具有高表達(dá)的基因，但對(duì)于惡性腫瘤患者，Tiam1可參與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、浸潤(rùn)的過(guò)程，在癌細(xì)胞擴(kuò)散中發(fā)揮重要的作用[1]。子宮頸癌是一種發(fā)病率及病死率較高的常見婦科惡性腫瘤，且其發(fā)病趨于年輕化，已成為臨床研究的重點(diǎn)[2]。但臨床關(guān)于Tiam1基因和蛋白與子宮頸癌的研究較少，對(duì)其在子宮頸癌中的作用機(jī)制尚不明確。鑒于此，本研究旨在探討Tiam1基因和蛋白在子宮頸癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2019年9月于本院行子宮頸組織手術(shù)切除的158例患者，根據(jù)留取組織不同分為正常宮頸組織組（n=46）、宮頸上皮瘤變組（n=52）、子宮頸癌組（n=60）。正常宮頸組織組年齡31～64歲，平均年齡（40.31±7.42）歲。宮頸上皮瘤變組年齡30～60歲，平均年齡（39.64±7.17）歲；分級(jí)：Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)10例。子宮頸癌組年齡34～69歲，平均年齡（41.23±7.89）歲；分型：鱗癌41例，腺癌19例。3組患者臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有患者均對(duì)本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 設(shè)備及試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）、總RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen）、逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒（日本Takara）、Tiam1和內(nèi)參引物（上海生工公司）、SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB試劑及PBS（北京中杉金橋公司）、兔抗人Tiam1多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz）。

1.3 方法3組患者均采集2份標(biāo)本，一份置于-80℃保存，一份制備成石蠟切片。①Tiam1 mRNA表達(dá)：取各組標(biāo)本組織研磨，加入細(xì)胞裂解液，采用總RNA提取試劑盒提取各組的總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，合格標(biāo)準(zhǔn)為A260/A280≥1.8。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA并用PCR試劑盒擴(kuò)增，引物序列依次為Tiam1引物、β-actin引物，同時(shí)，PCR反應(yīng)條件依次為：94℃預(yù)變性30 s；92℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)36次。對(duì)每份組織設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)孔，獲取其中Tiam1基因的相對(duì)表達(dá)量。②Tiam1蛋白表達(dá)：將各組的石蠟標(biāo)本切片、脫蠟和水化，置于濃度為3%的過(guò)氧化氫-甲醇在37℃下孵育30 min，并用PBS洗滌3次，置入檸檬酸緩沖液中煮沸10 min，冷卻后，再用PBS沖洗3次。常溫下滴入10%濃度的山羊血清，密閉存儲(chǔ)20 min，滴入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗體（1:500），置入4℃冰箱中孵育過(guò)夜，取出后用PBS沖洗3次，以同型的IgG作為對(duì)照，加入增強(qiáng)劑，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色并用蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，用光學(xué)顯微鏡觀察。由2位高經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師獨(dú)立評(píng)判，若細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或黃褐色染色即為陽(yáng)性，并對(duì)其評(píng)分。顏色評(píng)分：0分（不染色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0分（≤5%）、1分（6%～25%）、2分（26%～75%）、3分（＞75%）；總評(píng)分=顏色評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分。依據(jù)總評(píng)分將Tiam1蛋白表達(dá)換分為：陰性（0分）、弱陽(yáng)性（1～3分）、中等陽(yáng)性（4～6分）、強(qiáng)陽(yáng)性（7～9分）。

1.4 觀察指標(biāo) 檢測(cè)3組中Tiam1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，并分析與預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tiam1基因表達(dá) 正常宮頸組織組、宮頸上皮瘤變組、子宮頸癌組Tiam1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.26±0.17）、（1.76±0.23）、（2.06±0.18），子宮頸癌組Tiam1 mRNA水平明顯高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Tiam1蛋白表達(dá) 子宮頸癌組Tiam1蛋白陽(yáng)性率高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，且宮頸上皮瘤變組陽(yáng)性率高于正常宮頸組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組Tiam1蛋白陽(yáng)性率比較[n（%）]

2.3 子宮頸癌組織中Tiam1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系 以P25為Tiam mRNA為臨界值將子宮頸癌組分為高表達(dá)組（n=39）和低表達(dá)組（n=21），高表達(dá)組復(fù)發(fā)率為76.92%（30/39），明顯高于低表達(dá)組的42.86%（9/21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.963，P=0.008）；子宮頸癌組Tiam1蛋白陰性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為18.18%（2/11），明顯低于陽(yáng)性表達(dá)患者的71.43%（35/49），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.640，P=0.001）。

3 討論

子宮頸癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，因此，在行手術(shù)切除后仍有較高的復(fù)發(fā)率，而有學(xué)者認(rèn)為Tiam1與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與子宮頸癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，因此，從分子水平探討Tiam1在子宮頸癌組織內(nèi)的表達(dá)，分析其對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲的相關(guān)機(jī)制，有助于及早提高基因治療靶位，改善患者預(yù)后[3-4]。

本研究結(jié)果顯示，子宮頸癌組Tiam1 mRNA相對(duì)表達(dá)高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，且Tiam1 mRNA高表達(dá)者復(fù)發(fā)率較高，Tiam1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者復(fù)發(fā)率較高，表明Tiam1基因和蛋白與子宮頸癌密切相關(guān)，且其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。分析原因?yàn)?，Tiam1是普遍存在的二磷酸鳥嘌呤核苷酸（GDP）與三磷酸鳥嘌呤核苷酸（GTP）的轉(zhuǎn)換因子，較少出現(xiàn)在腦和睪丸以外的組織，已被研究證實(shí)在胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[5-6]。Tiam1作用于子宮頸癌的主要機(jī)制是通過(guò)作用于Rac1上游，其結(jié)構(gòu)內(nèi)的相關(guān)域同Ras產(chǎn)生相互作用，促進(jìn)GDP和GTP相互轉(zhuǎn)換，從而活化Rac1，促使細(xì)胞表面的整合素甲組遷移至細(xì)胞頭部，并調(diào)節(jié)信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞骨架的活性和形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)片狀偽足和膜多極化，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)并發(fā)生轉(zhuǎn)移[7-8]。另外，有研究表明，Tiam1刺激活化的Rac1可誘導(dǎo)MMPs活化，可活化多種外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的活性，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成，為惡性腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)，為癌細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)提供通道[9-11]。因此，Tiam1和惡性腫瘤的發(fā)展與預(yù)后密切相關(guān)，可為臨床靶點(diǎn)治療和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

綜上所述，Tiam1基因在子宮頸癌組織中呈高表達(dá)，Tiam1蛋白在子宮頸癌組織中呈較高的陽(yáng)性表達(dá)率，可參與子宮頸癌細(xì)胞的擴(kuò)散，二者高表達(dá)將導(dǎo)致患者不良預(yù)后。