范冬月，李 倩，鄒先偉，張君毅*

（1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021；2.清華大學工程物理系，北京 100084）

冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）屬于發(fā)菌科散囊菌屬，長期以來一直被認定為評價茯磚茶品質(zhì)的標準。與其他種類的茶相比，以冠突散囊菌為主要微生物的茯磚茶具有更多獨特的風味和功效[1-2]。除茯磚茶外，冠突散囊菌廣泛存在于康磚茶、綠茶、六寶茶、蟲草、土壤和木片[3-4]。

冠突散囊菌多糖和次生代謝產(chǎn)物具有良好的免疫增強活性、抗氧化活性和抗腫瘤活性[5]。由于具有易于培養(yǎng)和快速繁殖的特性，冠突散囊菌已成為重要的益生菌。近年來，冠突散囊菌的潛在藥用和抗菌特性已成為研究熱點。為了進一步開發(fā)冠突散囊菌的生物活性，冠突散囊菌與其他菌種共同發(fā)酵產(chǎn)物的研究也得到進一步研究。研究表明，混合發(fā)酵體系可以產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，增加產(chǎn)物香氣，而這些代謝產(chǎn)物很難通過單一真菌發(fā)酵獲得[6-7]。冠突散囊菌與黑曲霉（Aspergillus niger）共同發(fā)酵可顯著改善綠茶的品質(zhì)[8]，與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）共同發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可顯著抑制肝癌細胞和乳腺癌細胞的生長[9]。

因此，本研究將冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵，通過不同體積分數(shù)的乙醇對混合發(fā)酵液化學活性部位進行追蹤，并結合液質(zhì)聯(lián)用技術對活性部位化合物組成進行分析，通過四氮甲基唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、中性紅吞噬實驗及酶聯(lián)免疫吸附測定方法分別研究冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液活性部位對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌細胞因子的能力的影響，評價其是否具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。為進一步挖掘冠突散囊菌的生物活性，制備安全價格低廉的免疫調(diào)節(jié)劑提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）、木霉菌株（Tricho dermasp.）：清華大學工程物理系粒子技術與輻射成像教育部重點實驗室；小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株：國家實驗細胞資源共享平臺；胎牛血清：以色列BI公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（源自大腸桿菌）、蘆丁、沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、無水葡萄糖、硫酸、苯酚：美國Sigma公司；二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒、一氧化氮（NO）檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒、小鼠白細胞介素6酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（mouse interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assaykit，Mouse IL-6 ELISA Kit）、小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（mouse tumor necrosis factor-α enzyme-linked immunosorbent assay kit，Mouse TNF-α ELISA Kit）。所用試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：以色列BI公司。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖50 g/L、蛋白胨2.5 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 0.15 g/L、FeSO4·7H2O 0.25 g/L、維生素B 0.11 g/L，調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值至6.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash多功能酶標儀、HERAcell細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；Venticell強對流精密烘箱：德國MMM公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：北京天林恒泰科技有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計：日本島津公司；TH4-200型倒置顯微鏡：美國OLYMPUS公司；SVE-4A1垂直流超凈工作臺：新加坡ESCO公司；Ultimate 3000/Q-Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrum，UHPLC-MS）儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌與木霉分別發(fā)酵和深層混合發(fā)酵

將冠突散囊菌、木霉和混合菌株分別以1×106個/mL接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL，于28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵8 d（D8）、10 d（D10）、12 d（D12）及14 d（D14）時收集樣品，取1 mL發(fā)酵液置于2 mL離心管中，置于55 ℃恒溫強對流精密烘箱至干燥，備用。

1.3.2 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液免疫活性比較

將冠突散囊菌與木霉的混合發(fā)酵液及單菌發(fā)酵液分別用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至2 mg/mL，采用MTT法[11]檢測不同樣品對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖率的影響。將小鼠巨噬細胞RAW264.7以1×106個/mL的密度接種于96孔板中，每孔接種200 μL，在37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。調(diào)零組不接種細胞，陰性對照組每孔加PBS溶液20 μL，陽性對照組每孔加2.5 μg/mL LPS，實驗組每孔給藥質(zhì)量濃度為200 μg/mL。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，置于37 ℃，4 h后棄上清液，并加入100 μL DMSO溶液，振蕩5 min后，置于波長570 nm處測定吸光度值，計算細胞增值率，其計算公式如下：

式中：A是實驗組或陽性對照組吸光度值；B是陰性對照組吸光度值；C是調(diào)0組吸光度值。

1.3.3 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液免疫活性物質(zhì)的分離

稱取10 g冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液干燥后的粉末以1∶10（g∶mL）的料液比加入水，充分溶解后分別加入體積分數(shù)分別為70%和90%的乙醇，充分振蕩30 min，分別收集乙醇層樣品和不溶于乙醇的沉淀，蒸發(fā)干燥。其中由體積分數(shù)70%乙醇沉淀的樣品標記為ETW1，體積分數(shù)90%乙醇沉淀的樣品標記為ETW2，體積分數(shù)70%乙醇提取的樣品標記為ETE1，體積分數(shù)90%乙醇提取的樣品標記為ETE2。分別取樣品ETW1、ETW2、ETE1、ETE2 2 mg加PBS溶液配置成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。采用MTT法檢測不同樣品對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖率的影響，對樣品的免疫活性進行篩選。

1.3.4 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物化學成分分析

總糖含量：采用硫酸-苯酚法檢測[12]；總蛋白含量：采用二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒檢測；總多酚含量：采用福林酚比色法檢測[13]；總黃酮含量：采用分光光度法檢測[14]；活性成分采用UHPLC-MS分析[15]。

1.3.5 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物內(nèi)毒素的檢測

為避免熱原對結果的影響，通過內(nèi)毒素檢測試劑盒對冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物及LPS中的熱原進行檢測。

1.3.6 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對RAW264.7細胞增殖能力的影響

取處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細胞，以1×106個/mL的細胞密度，每孔200 μL接種于96孔板上，在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 mL PBS溶液（陰性對照組），100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS（陽性對照組），每組設6個重復。24 h后棄上清液，采用MTT法測定冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對RAW264.7細胞增殖能力的影響。

1.3.7 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對RAW264.7細胞吞噬中性紅的影響

取處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細胞，用吸管將細胞輕輕吹落，以5×105個/mL的細胞密度，每孔100 μL接種于96孔板上，在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 mL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每組設6個重復。24 h后棄上清液，向每孔中加入100 μL 0.1%的中性紅溶液，培養(yǎng)1 h后，棄中性紅溶液，PBS緩沖液沖洗3次后，向每孔加入100 μL由無水乙醇和冰醋酸體積比為1∶1配制的細胞裂解液靜置1.5 h，在波長540 nm處用酶標儀檢測樣品吸光度值[16]。

1.3.8 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對RAW264.7細胞分泌NO、IL-6、TNF-α的影響

取對數(shù)生長期、細胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細胞，以5×105個/mL的細胞密度接種于96孔板，每孔接種100 μL，在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 μL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每組設6個重復。24 h后取不同體積的細胞上清液，采用Griess試劑盒[17]和ELISA試劑盒[18]根據(jù)試劑盒說明書進行檢測。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結果用“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計分析，顯著水平差異表現(xiàn)為P＜0.05，極顯著水平差異為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液免疫活性

發(fā)酵8 d時，冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響見表1。

由表1可知，與陰性對照組比較，陽性對照組對小鼠RAW264.7細胞的增殖有極顯著的促進作用，增殖率達30.60%；發(fā)酵8 d時，木霉發(fā)酵液對小鼠RAW264.7細胞的增殖具有微弱的促進作用，增殖率達到5.74%；冠突散囊菌發(fā)酵液對小鼠RAW264.7細胞也有一定促進作用，增殖率達到17.31%；但兩菌混合發(fā)酵后其混合發(fā)酵液對小鼠RAW264.7細胞增殖效果最好，增殖率達59.51%。

表1 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液及單菌發(fā)酵液對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響Table 1 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma sp.co-fermentation liquid and single strain fermentation liquid on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

研究不同發(fā)酵時間冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響，結果見表2。

表2 不同發(fā)酵時間冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響Table 2 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid with different fermentation time on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

由表2可知，與陰性對照組相比，冠突散囊菌與木霉的混合發(fā)酵液對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖有促進作用，且隨著發(fā)酵時間的延長，小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖率呈下降趨勢。當發(fā)酵第8天時，小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖率最高，為59.51%，說明冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對巨噬細胞有激活作用，且發(fā)酵第8天時，激活作用最好。

2.2 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液免疫活性物質(zhì)的分離與分析

對冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵的產(chǎn)物進行免疫活性追蹤研究，結果見表3。由表3可知，陽性對照組小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖率為30.60%，冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液各分離組分中，小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖率均顯著高于陰性對照組，其中ETE1組，小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖率最高，達到47.39%，說明各分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7有很好的激活作用，其中體積分數(shù)70%乙醇提取物激活細胞作用最好，對其進行進一步研究。

表3 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液不同體積分數(shù)乙醇分離成分對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖率的影響Table 3 Effect of different volume fraction ethanol isolation components of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid on proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

分別利用硫酸-苯酚法、BCA法、福林酚法、分光光度法對ETE1分離組分中的總糖、總蛋白、總多酚、總黃酮含量進行檢測分析，結果見表4。

表4 ETE1分離組分中化學成分的分析Table 4 Analysis of chemical compositions in isolation component ETE1

由表4可知，在ETE1分離組分中，總蛋白（0.04 mg/g）和總多酚（31.41 μg/g）含量較高，總黃酮（0.08 μg/g）和總糖（0.13 mg/g）含量較低，黃酮類化合物屬于多酚類化合物[19]。由于真菌混合發(fā)酵液成分復雜，UHPLC-MS聯(lián)用技術能夠在缺少標準品的條件下，對單組分進行定性分析。因此，采用該技術對真菌混合發(fā)酵液進行進一步分析，UHPLC-MS總離子流色譜圖見圖1。

圖1 ETE1分離組分超高液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of isolation component ETE1 analyzed by UHPLC-MS

由圖1可知，通過UHPLC-MS聯(lián)用技術檢測出了保留時間為1.523min、16.615 min、17.061min、18.547 min、18.904 min、21.733 min、22.06 min、36.194 min、49.649 min的強峰。根據(jù)Compound Discover 3.1.0.305和mzcloud和mzVault數(shù)據(jù)庫比對結果分析得到相關化合物信息，結果見表5。由表5可知，從ETE1分離組分中檢測出了5-羥甲基糠醛、生物素、麥芽酚、3-羥基苯甲酸、2,6-二甲基-γ-吡喃酮、二芐胺、芥子堿、大黃素、十三嗎啉。其中大黃素是常見的中藥活性成分，具有廣泛的藥理作用如抗炎，抗腫瘤，抗細菌等[20]。芥子堿為常見的天然抗氧化劑，具有抗炎的作用，常見于十字花科藥用植物[21]。

表5 ETE1分離組分UHPLC-MS分析結果Table 5 Analysis results of isolation component ETE1 by UHPLC-MS

2.3 ETE1分離組分中內(nèi)毒素的檢測

細菌內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性菌的外壁，主要成分為脂多糖，是菌體中存在的毒性物質(zhì)，具有致熱性也稱為“熱原”，內(nèi)毒素能夠?qū)е戮奘杉毎募せ頪22]，如果樣品中含有熱原，會在一定程度上影響實驗結果，為了避免熱原對實驗結果的影響，本研究利用顯色鱟試劑盒對ETE1分離組分中的內(nèi)毒素含量進行檢測，結果見表6。由表6可知，質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL的LPS中內(nèi)毒素含量為（1.36±0.35）EU/mL，是質(zhì)量濃度為1000μg/mL的ETE1分離組分[（0.39±0.01）EU/mL]的3倍，由此可知，ETE1分離組分對于巨噬細胞的增殖作用不是因為熱原引起的，對小鼠巨噬細胞RAW264.7有良好的激活作用。

表6 ETE1分離組分中內(nèi)毒素含量檢測結果Table 6 Determination results of endotoxin content in isolation component ETE1

2.4 ETE1分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

有關巨噬細胞防御的研究對于先天免疫和適應性免疫很重要。巨噬細胞分布在人體的各個器官和組織上，在人體不同的微環(huán)境中顯示出明顯的功能差異[23]。本實驗通過MTT 法研究不同質(zhì)量濃度ETE1 對小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖作用，結果見圖2。由圖2可知，與陰性對照組相比，陽性對照組、不同質(zhì)量濃度的ETE1分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖均具有極顯著的促進作用（P＜0.01），且隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，促進作用越好。

圖2 不同質(zhì)量濃度的ETE1對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響Fig.2 Effect of different mass concentrations of ETE1 on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

2.5 ETE1分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響

巨噬細胞對異物的吞噬能力，也一定程度上反應了巨噬細胞的活力[24]。巨噬細胞在外界異物刺激后進入活化狀態(tài)，激活的巨噬細胞胞飲作用速度也進一步增加[25]。中性紅是一種堿性染色劑，能夠被巨噬細胞攝入，通過測量吞噬中性紅后裂解的巨噬細胞的吸光度值，對巨噬細胞的吞噬能力進行評價[26]。不同質(zhì)量濃度的ETE1對吞噬中性紅后巨噬細胞RAW264.7形態(tài)的影響見圖3，對巨噬細胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響見圖4。

由圖3可知，隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，小鼠RAW264.8細胞的分化程度逐漸加強，形變程度增加。由圖4可知，與陰性對照組相比，陽性對照組及不同質(zhì)量濃度的ETE1（除500 μg/mL）均可顯著促進小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬中性紅能力（P＜0.05）。且除質(zhì)量濃度500 μg/mL，隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，促進作用越好。

圖3 不同質(zhì)量濃度的ETE1對吞噬中性紅后小鼠巨噬細胞RAW264.7形態(tài)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ETE1 on the morphology of mouse macrophages RAW264.7 after phagocytosis of neutral red

圖4 不同質(zhì)量濃度的ETE1對小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ETE1 on the phagocytosis of neutral red in mouse macrophages RAW264.7

2.6 ETE1分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO、TNF-α及IL-6能力的影響

活化的巨噬細胞能夠通過釋放一氧化氮（NO）對病原體進行抑制，有一定的殺菌作用[27]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）TNF-α屬于單核因子主要由巨噬細胞產(chǎn)生，對癌變的細胞和被病毒感染的細胞由細胞毒作用，能夠正向調(diào)節(jié)吞噬細胞的吞噬作用，增強巨噬細胞的胞飲能力，能夠增強淋巴細胞對外界病原微生物的響應[28]。白介素（interleukin，IL）IL-6）是由多種免疫細胞產(chǎn)生，介導白細胞發(fā)揮作用，促進B細胞分化的一類細胞因子[29]。不同質(zhì)量濃度的ETE1對小鼠巨噬細胞分泌NO、TNF-α及IL-6的影響見圖5。由圖5可知，與陰性對照組相比，陽性對照組及不同質(zhì)量濃度的ETE1能顯著促進小鼠細胞分泌NO、TNF-α及IL-6的能力（P＜0.01），且隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，NO、TNF-α及IL-6的分泌量越來越高，但均低于陽性對照組。SCHEPETKIN I A等[30]研究發(fā)現(xiàn)，具有多重藥理活性的杜松能夠促進TNF-α、IL-6的分泌，由此推測ETE1也可能具有一定的藥理活性。

圖5 不同質(zhì)量濃度的ETE1對小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）及IL-6（C）能力的影響Fig.5 Effect of different concentrations of ETE1 on NO（A），TNF-α（B）and IL-6（C）secretion ability of mouse macrophages RAW 264.7

3 結論

將冠突散囊菌與木霉共同發(fā)酵，采用體積分數(shù)為70%乙醇提取的部位有較好的免疫活性，通過UHPLC-MS聯(lián)用技術分析，該部位含有大黃素、芥子堿等生物活性成分。通過四氮甲基唑藍（MTT）比色法、中性紅吞噬實驗及酶聯(lián)免疫吸附測定方法分別研究冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液活性部位對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌細胞因子的能力的影響。結果表明，與陽性對照組脂多糖相比，500 μg/mL冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液的體積分數(shù)70%乙醇提物能夠使小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖率提高12%，增強小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬中性紅的能力，并能促進NO及細胞因子IL-6、TNF-α的分泌。