王俊芳，張 震，申夢雨，王 剛

（河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004）

殼聚糖酶通常被認為是一類對殼聚糖有專一水解性，以內(nèi)切方式在部分乙?；瘹ぞ厶侵写呋猞?1,4糖苷鍵生成殼寡糖的酶。殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）是殼聚糖的水解產(chǎn)物，是一種由β-（1,4）-2-氨基-D-氨基葡萄糖和β-（1,4）-2-乙酰氨基-D-氨基葡萄糖單元組成的多聚糖。COS聚合度一般為2～10，易溶于水，黏度低，易被吸收，生物活性豐富，在食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-3]；具有抗腫瘤、抑菌、殺菌、抗氧化、增強免疫力和吸附重金屬等重要機能[4-7]。目前，COS產(chǎn)品制備方法有化學(xué)法、酶法、高能沖擊和基因工程重組等方法[8-9]。其中酶法具有產(chǎn)物特異性強、安全、環(huán)保和副產(chǎn)物少等特點。

殼聚糖酶主要由微生物（真菌、細菌和放線菌）和植物產(chǎn)生，該酶在微生物和植物的對外防御和營養(yǎng)功能上起著重要的作用[10-15]。殼聚糖酶的應(yīng)用除COS制備，還應(yīng)用于植物真菌病原菌生防治、真菌原生質(zhì)體的制備和甲殼類廢物的生物轉(zhuǎn)化等。近年來，隨著應(yīng)用加劇使殼聚糖酶的研究備受關(guān)注[16-18]。雖已篩選出了大量產(chǎn)殼聚糖酶菌株，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同殼聚糖酶產(chǎn)生菌降解殼聚糖的產(chǎn)物、降解方式和適宜的酶解條件不盡相同[19-22]，而且野生菌的酶活性普遍較低，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，殼聚糖酶來源有限，使得商品化的殼聚糖酶價格較高，生產(chǎn)成本難以下降，致使酶法制備COS造價較高，限制了該法的推廣應(yīng)用。因此，需要開發(fā)更多類型、適應(yīng)條件廣的殼聚糖酶降解菌來滿足工業(yè)化需求，通過殼聚糖酶產(chǎn)生菌的作用，有助于COS的開發(fā)應(yīng)用。

該試驗分離獲得一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株G10，研究旨在利用紫外和微波復(fù)合誘變技術(shù)對野生型菌株進行改造，選育殼聚糖酶產(chǎn)量高、酶活性強的突變菌株，并通過正交試驗優(yōu)化酶活發(fā)酵工藝條件，以期為殼聚糖酶的進一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為大幅提高COS的應(yīng)用技術(shù)能力提供一些技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）G10：河南大學(xué)微生物實驗室。

1.1.2 試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：上海國藥試劑集團；殼聚糖（脫乙酰度≥90%）：廣州化工集團。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基[23]：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.2；固體LB培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基添加瓊脂1.8%。121 ℃滅菌20 min。

液體金氏培養(yǎng)基B（King's B medium，KBM）[24]：蛋白胨2.0%，甘油1.0%，K2HPO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH7.2；固體KBM培養(yǎng)基：液體KBM培養(yǎng)基添加瓊脂2.0%。121 ℃滅菌20 min。

初篩液體發(fā)酵培養(yǎng)基：液體KBM培養(yǎng)基添加0.1%膠體殼聚糖；復(fù)篩液體發(fā)酵培養(yǎng)基：液體KBM培養(yǎng)基添加0.5%膠體殼聚糖。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO-RAD iMark酶標儀：美國伯樂公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱：上海百典儀器設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種誘變

菌株的活化：以斜面培養(yǎng)16～18 h的菌株G10為出發(fā)菌，接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，使細胞處于對數(shù)生長期；將上述培養(yǎng)物置于4～7 ℃儲藏1 h，誘導(dǎo)同步生長，然后冰浴10 min。4 ℃條件下，將菌懸液12 000 r/min離心，去上清，重懸浮菌體細胞，將細胞濃度調(diào)整至108CFU/mL[25]。

紫外誘變：取上述菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，使培養(yǎng)皿底部離紫外燈管約30 cm，打開皿蓋，分別對平板進行不同時間的紫外照射，照射時間為0、5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s和90 s，照射結(jié)束后28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h。以不照射的菌液為對照，計算致死率。

微波誘變：對紫外誘變獲得的正突變株中遺傳穩(wěn)定的菌株進行微波誘變。取600 μL菌懸液置于1.5 mL離心管中，并將離心管置于裝滿冷水的燒杯中，微波爐中輻照。輻照檔位功率為700 W，脈沖頻率2 540 MHz，每隔10 s換水一次，冷卻降溫。輻照時間為0、10 s、20 s、30 s、50 s、60 s、80 s、90 s、110 s和120 s，輻照結(jié)束，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h。以不照射的菌液為對照，計算致死率。

1.3.2 突變菌株的篩選

突變菌株的初篩：根據(jù)致死曲線，在最佳紫外和微波時長誘變條件下，挑取誘變后生長速度快的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，180 r/min振蕩培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。然后將菌液分別定量點接于膠體殼聚糖平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。以菌株G10為對照菌株，挑取透明圈相對大的菌落。

突變菌株的復(fù)篩：將初篩的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，進行搖瓶培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)40 h。分別測定不同菌株發(fā)酵液殼聚糖酶活，根據(jù)酶活大小篩選高產(chǎn)菌株。以菌株G10為對照菌株。

菌株遺傳穩(wěn)定性：經(jīng)過初篩和復(fù)篩后，將待測菌株進行連續(xù)10代培養(yǎng)，接種復(fù)篩液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，分別測定其殼聚糖酶活力。

1.3.3 殼聚糖酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗

培養(yǎng)條件的優(yōu)化：菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化前的培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)基初始pH值7.2，裝液量為30 mL/250 mL。以此條件為參照，將活化的菌種接入裝有30 mL復(fù)篩液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，分別對培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（150 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min和240 r/min）、初始pH值（6.8、7.0、7.2、7.4和7.6）、培養(yǎng)溫度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃和37 ℃）進行優(yōu)化，培養(yǎng)24 h。利用DNS法測定發(fā)酵液殼聚糖酶活。

培養(yǎng)基成分的優(yōu)化：以加有0.5%膠體殼聚糖的KBM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和甘露醇替代甘油；分別用2%的酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl和尿素替代蛋白胨；分別用0.3%的FeCl2、K2HPO4、LiSO4、CaCl2、MnSO4和NaCl替代MgSO4·7H2O+K2HPO4；考察不同碳源、氮源、無機鹽對殼聚糖酶活的影響。按1.3.2優(yōu)化后的培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液殼聚糖酶活。

1.3.4 殼聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

通過單因素試驗初步考查MgSO4·7H2O（A）、果糖（B）和酵母粉（C）添加量對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，優(yōu)化菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.5 殼聚糖酶活力測定

取待測發(fā)酵液3mL，于4℃條件下8000r/min離心10min，得上清即為粗酶液。取1 mL粗酶液，加0.1%的膠體殼聚糖1 mL，30 ℃水浴保溫15 min；加入2 mol/L的NaOH溶液0.2 mL終止反應(yīng)，5000r/min離心5min，取上清液1mL與1mL的DNS試劑混合，沸水浴5 min，冷卻，加入蒸餾水，定容至10 mL，酶標儀測定OD520nm值。

取粗酶液1 mL與1 mL的DNS試劑混合，沸水浴5 min，冷卻后加入蒸餾水，定容至10 mL，酶標儀測定OD520nm值，以此為空白對照。根據(jù)氨基葡萄糖標準曲線和酶活力單位定義，計算殼聚糖酶活力[26]。

殼聚糖酶活力單位定義為：在30 ℃條件下，1 mL酶液每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量為一個殼聚糖酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變條件的確定

由圖1可知，隨著照射時間的延長，菌體致死率逐漸提高，60 s、70 s和80 s照射時間時菌體致死率分別為81.5%、95%和100%。通過對紫外線、微波、烷化劑等誘變劑的誘變結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，突變株正向突變多出現(xiàn)在菌體致死率為80%～90%時[27]。因此，選擇紫外誘變照射時間為60 s。

圖1 紫外照射時間對菌體致死率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on strain lethality

2.2 微波誘變條件確定

由圖2可知，輻射時間為50 s時致死率為83%，輻射時間為60 s時致死率為91%。由于誘變致死率80%～90%之間突變菌株發(fā)生正突變概率高[27]。因此，選擇微波照射時間為50 s。

圖2 微波照射時間對菌體致死率的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation time on strain lethality

2.3 殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的初篩及復(fù)篩

紫外誘變結(jié)果：菌株G10經(jīng)紫外誘變后，初篩出72株高產(chǎn)殼聚糖酶菌株。利用搖瓶培養(yǎng)法進行高產(chǎn)菌復(fù)篩，篩選到一株殼聚糖酶活相對較高的突變菌株，編號為Z1-15。經(jīng)測定，出發(fā)菌株G10產(chǎn)殼聚糖酶酶活為1.72 U/mL，菌株Z1-15產(chǎn)殼聚糖酶酶活為3.35 U/mL。

微波照射誘變結(jié)果：對紫外誘變篩選出的殼聚糖酶高產(chǎn)菌Z1-15進行微波照射誘變。篩選出102株突變株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩測其殼聚糖酶活，選出一株產(chǎn)殼聚糖酶活較高的菌株W1-32，其產(chǎn)殼聚糖酶酶活為6.53 U/mL。

2.4 菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶穩(wěn)定性測定

菌株W1-32經(jīng)過10次傳代和搖瓶培養(yǎng)，對其殼聚糖酶活分別進行測定，結(jié)果見表1。由表1可知，該菌株傳代10次后產(chǎn)殼聚糖酶酶活為6.531 U/mL，產(chǎn)殼聚糖酶穩(wěn)定。

表1 菌株W1-32不同傳代次數(shù)殼聚糖酶活Table 1 Chitosanase activity of different passages of strain W1-32

2.5 培養(yǎng)條件對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

2.5.1 初始pH對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

由圖3可知，隨培養(yǎng)基初始pH的升高，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活呈先增大后減小的趨勢；培養(yǎng)基初始pH值為7.2時，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活最高，為6.552 U/mL。因此，選擇菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶培養(yǎng)基的最佳初始pH值為7.2。

圖3 初始pH對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響Fig.3 Effect of initial pH on chitosanase activity produced by strain W1-32

2.5.2 轉(zhuǎn)速對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的提高，菌株產(chǎn)殼聚糖酶活呈先升高后下降的趨勢；轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌株發(fā)酵液相對酶活最高，酶活為6.613 U/mL。因此，選擇菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響Fig.4 Effect of rotational speed on chitosanase activity produced by strain W1-32

2.5.3 溫度對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度升高，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活呈先升高后降低的趨勢；結(jié)果表明溫度為28 ℃時，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活性最高，酶活為6.530 U/mL。因此，選擇菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃。

圖5 溫度對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on chitosanase activity produced by strain W1-32

2.6 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

碳源、氮源、無機鹽對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響見圖6～圖8。

圖6 碳源對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響Fig.6 Effect of carbon source on chitosanase activity produced by strain W1-32

圖7 氮源對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on chitosanase activity produced by strain W1-32

圖8 無機鹽對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活的影響Fig.8 Effect of inorganic salts on chitosanase activity produced by strain W1-32

由圖6可知，不同碳源條件下酶活差異極顯著（P＜0.01）；結(jié)果顯示以果糖為碳源時，該菌株產(chǎn)殼聚糖酶活最高，酶活為6.563 U/mL。因此最佳碳源為果糖。

由圖7可知，不同氮源條件下菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活差異極顯著（P＜0.01）；結(jié)果表明以酵母粉為氮源時，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活最高，酶活為6.532 U/mL。因此，選擇菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶的最佳氮源為酵母粉。

由圖8可知，不同無機鹽條件下菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活差異極顯著（P＜0.01）；結(jié)果顯示所選的七種不同的鹽中，添加MgSO4·7H2O時，菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活最高，酶活為6.612 U/mL。因此，選擇菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶的最佳無機鹽為MgSO4·7H2O。

2.7 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

由表2可知，3個因素對菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活影響大小順序為RB＞RC＞RA，即果糖添加量影響最大，酵母粉添加量次之，MgSO4·7H2O添加量影響最小。綜合各因素培養(yǎng)基優(yōu)水平組合為A2B3C2，即MgSO4·7H2O 0.3%，果糖1.3%，酵母粉2.0%。

表2 菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization of chitosanase produced by strain W1-32

2.8 優(yōu)化條件下菌株W1-32的殼聚糖酶活

由圖9可知，在優(yōu)化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基條件下，8 h前酶活增長緩慢；10～18 h酶活快速增長，24 h時酶活達最高11.82 U/mL，超過30 h后，酶活逐漸下降。

圖9 菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶活力曲線Fig.9 Curve of chitosanase activity produced by strain W1-32

3 結(jié)論

以具有產(chǎn)殼聚糖酶能力的枯草芽孢桿菌G10為出發(fā)菌株，利用紫外和微波復(fù)合誘變法，選育高產(chǎn)殼聚糖酶突變株。篩選出一株酶活相對較高突變菌株W1-32菌株。通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基初始pH值為7.2，最適宜培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度28 ℃，最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為：果糖1.3%、膠體殼聚糖0.5%，酵母粉2.0%、MgSO4·7H2O 0.3%；優(yōu)化后菌株W1-32產(chǎn)殼聚糖酶酶活為11.82 U/mL，是出發(fā)菌株的6.9倍。