魏書(shū)信，劉麗娜，高帥平，王安建，李順?lè)澹迖?guó)梅，田廣瑞，許方方

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）是我國(guó)主栽的食用菌品種之一，素有山珍之稱(chēng)，是一類(lèi)富含蛋白質(zhì)、維生素，不含膽固醇，脂肪含量低的天然健康食品，深受人們的喜愛(ài)，享有植物性食品頂峰的美稱(chēng)[1-2]。切柄干制是香菇最主要的加工形式，香菇柄是香菇加工最大的副產(chǎn)物資源，約占香菇總質(zhì)量的25%～30%，產(chǎn)量十分巨大[3]。香菇柄的營(yíng)養(yǎng)和香菇菌蓋基本相同，富含蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多種維生素、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的開(kāi)發(fā)潛力和市場(chǎng)價(jià)值。香菇柄主要以干品的形式上市銷(xiāo)售，干香菇柄復(fù)水后直接烹調(diào)食用具有堅(jiān)韌難嚼的特點(diǎn)[4]，這極大的限制了香菇柄的大規(guī)模食品開(kāi)發(fā)[5]。

多年以來(lái)，研究人員在開(kāi)發(fā)香菇柄加工產(chǎn)品方面進(jìn)行了諸多嘗試研究，在普通食品上開(kāi)發(fā)出香菇醬、香菇松、香菇柄素蹄、香菇柄牛蒡小饅頭、香菇柄兔肉松等產(chǎn)品[6-9]，在保健食品上主要圍繞香菇膳食纖維、香菇多糖、香菇抗氧化活性物質(zhì)、酚類(lèi)化合物、微量功能成分等功能保健成分提取純化進(jìn)行了相關(guān)研究[10-15]，但真正產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的較少，深加工利用香菇柄原料極為有限。

本實(shí)驗(yàn)從應(yīng)用實(shí)際出發(fā)，基于香菇柄富含纖維類(lèi)碳水化合物的特點(diǎn)，以廉價(jià)香菇柄為試驗(yàn)原料，選取糖化效果最好的兩種酶——纖維素酶和糖化酶，設(shè)計(jì)雙酶同步糖化制備香菇柄水解液，提高其還原糖含量，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化糖化工藝條件，以期得到無(wú)酸堿處理的高還原糖香菇柄水解液，為后續(xù)香菇柄酒等發(fā)酵食品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄：市售；纖維素酶（酶活20 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；糖化酶（酶活50 000 U/g）：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；酒石酸鉀鈉、硫酸銅、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S即熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；HC-3018R冷凍離心機(jī)：安徽中科中甲科學(xué)儀器有限公司；GZX-9140 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 香菇柄預(yù)處理工藝

挑選無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變、色澤正常的香菇柄，去除塑料薄膜等雜質(zhì)，經(jīng)55 ℃烘干2 h，晾涼后粉碎、過(guò)60目篩，得香菇柄粉備用。

1.3.2 雙酶同步糖化酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-17]

稱(chēng)取6份香菇柄粉，每份10 g，固定酶解溫度為50 ℃，分別按料液比（1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶19、1∶22（g∶mL））加入純凈水，調(diào)節(jié)pH值為4.8，纖維素酶和糖化酶酶活比分別為（2∶6、3∶5、4∶4、5∶3、6∶2、7∶1），雙酶添加量分別為（2 000 U/g、2 400 U/g、2 800 U/g、32 00 U/g、36 00 U/g），50 ℃恒溫酶解（50 min、70 min、90 min、110 min、130 min、150 min），酶解結(jié)束升溫至95 ℃保持20 min滅酶，水浴冷卻后5 000 r/min離心10 min得酶解液，測(cè)定其還原糖含量，計(jì)算還原糖得率，考察各單因素對(duì)香菇柄酶解還原糖得率的影響。

1.3.3 雙酶同步糖化酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[18-19]

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3，以雙酶添加量（A）、料液比（B）、酶解時(shí)間（C）為響應(yīng)因子，以還原糖得率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment design

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》中的直接滴定法進(jìn)行還原糖含量測(cè)定，還原糖得率計(jì)算公式如下：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均進(jìn)行3次重復(fù)取平均值。采用Origin 8.5制圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化雙酶同步糖化工藝

2.1.1 纖維素酶和糖化酶酶活比對(duì)還原糖得率的影響

纖維素酶和糖化酶雙酶添加量為2 800 U/g底物，料液比為1∶10（g∶mL）、酶解pH值為4.8、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間90 min，考察纖維素酶和糖化酶酶活比對(duì)香菇柄酶解還原糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，纖維素酶和糖化酶酶活比為2∶6～5∶3范圍內(nèi)，還原糖得率有明顯的上升趨勢(shì)；纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3時(shí)，還原糖得率最高；纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3～7∶1范圍內(nèi)，還原糖得率有所下降。因此，纖維素酶和糖化酶最佳酶活比為5∶3。

圖1 纖維素酶和糖化酶酶活比對(duì)還原糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulase and glucoamylase activity ratio on reducing sugar yield

2.1.2 雙酶添加量對(duì)還原糖得率的影響

纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3，料液比為1∶10（g∶mL）、酶解pH值為4.8、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間90 min，考察雙酶添加量對(duì)香菇柄酶解液還原糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 雙酶添加量對(duì)還原糖得率的影響Fig.2 Effect of double enzyme addition on reducing sugar yield

由圖2可知，隨著雙酶添加量在2 000～3 200 U/g范圍的增加，還原糖得率呈逐漸增加的趨勢(shì)；當(dāng)雙酶添加量為3 200U/g時(shí)，還原糖得率達(dá)到最高；當(dāng)雙酶添加量＞3 200 U/g之后，還原糖得率稍有降低。因此，最佳雙酶添加量為3 200 U/g。

2.1.3 料液比對(duì)還原糖得率的影響

纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3，雙酶添加量為3200U/g，酶解pH值為4.8、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間90 min，考察不同料液比對(duì)香菇柄酶解液還原糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著料液比在1∶7～1∶22（g∶mL）時(shí)，還原糖得率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶16（g∶mL）時(shí)，還原糖得率最大為8.61%；當(dāng)料液比為1∶16～1∶19（g∶mL），還原糖得率有所下降。原因可能是料液比越高，香菇柄粉中的還原糖越容易溶出，然而過(guò)高的水分含量會(huì)過(guò)度稀釋酶制劑的濃度，且令酶解底物濃度過(guò)低，只有在適宜的料液比下，酶制劑方可充分發(fā)揮作用。因此，最佳料液比為1∶16（g∶mL）。

圖3 料液比對(duì)還原糖得率的影響Fig.3 Effect of material and liquid ratio on reducing sugar yield

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

纖維素酶和糖化酶酶活比為5∶3，雙酶添加量為3200U/g，料液比為1∶16（g∶mL），酶解溫度為50 ℃、酶解pH值為4.8，考察不同酶解時(shí)間對(duì)香菇柄酶解液還原糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on reducing sugar yield

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間在50～110 min范圍內(nèi)增加，還原糖得率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為110 min時(shí)，還原糖得率達(dá)到最大值；酶解時(shí)間＞110 min之后，還原糖得率有所下降。因此，最佳酶解時(shí)間為110 min。

2.2 雙酶同步糖化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

固定纖維素酶和糖化酶最佳酶活比為5∶3，以雙酶添加量（A）、料液比（B）、酶解時(shí)間（C）為響應(yīng)因子，以還原糖得率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments design

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到香菇柄雙酶同步糖化工藝的二次回歸模型：Y=10.71-0.18A-0.079B+0.13C-0.04AB-0.47AC-0.083BC-1.21A2-0.24B2-0.2C2。

模型P=0.000 2＜0.01，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.371 0＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合性好，可用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)糖化工藝條件。回歸方程決定系數(shù)R2=0.967 2、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.925 0，表明該回歸模型能夠解釋92.5%的響應(yīng)值的變化，說(shuō)明應(yīng)用該模型擬合性較好，可信度較高[20]。一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)B2對(duì)還原糖得率的影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、交互項(xiàng)AC對(duì)還原糖得率的影響極顯著（P＜0.010）。由P值大小比較可知，3因素對(duì)還原糖得率影響大小順序?yàn)椋弘p酶添加量＞酶解時(shí)間＞料液比。

響應(yīng)面圖能直觀(guān)地反應(yīng)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[21]。依據(jù)二次回歸模型方程做出各因素交互作用對(duì)還原糖得率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 雙酶添加量、料液比及酶解時(shí)間交互作用對(duì)還原糖得率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between double enzyme addition,material and liquid ratio and enzymolysis time on reducing sugar yield

由圖5可知，雙酶添加量與酶解時(shí)間響應(yīng)面圖的曲面坡度陡峭且其等高線(xiàn)橢圓較扁，說(shuō)明這兩個(gè)因素之間交互作用顯著（P＜0.05）；雙酶添加量與料液比響應(yīng)面圖的曲面坡度較陡峭，其等高線(xiàn)圖呈橢圓，說(shuō)明這兩個(gè)因素之間具有一定的交互作用；料液比與酶解時(shí)間響應(yīng)面圖的曲面較平緩，其等高線(xiàn)圖近圓形，說(shuō)明這兩個(gè)因素的交互作用較弱。

根據(jù)響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型分析，預(yù)測(cè)出最佳糖化工藝條件為雙酶添加量3 164.25 U/g、料液比1∶15.25（g∶mL）、酶解時(shí)間121.41 min。在此條件下還原糖得率的預(yù)測(cè)值為11.00%。為了便于實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)修改為雙酶添加量3 164 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解時(shí)間120 min。在此糖化工藝條件下，做平行試驗(yàn)3次，還原糖得率實(shí)際值為11.05%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明模型方程與實(shí)際試驗(yàn)具有良好的擬合性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙酶同步糖化工藝條件為：纖維素酶和糖化酶酶活比5∶3、雙酶添加量3 164 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解時(shí)間120 min。該優(yōu)化糖化工藝條件下，香菇柄還原糖得率達(dá)11.05%，較原香菇柄中還原糖含量1.814%有顯著提升。香菇柄雙酶同步酶解糖化工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、安全性高，可快速提升還原糖含量，對(duì)香菇柄釀造酒等發(fā)酵食品的開(kāi)發(fā)具有一定的借鑒意義。