何成偉，萬道正，鐘 勇，藍(lán)翊文，廖才偉，龍書漢，韋景耀，葉海波

（1.憑祥海關(guān)，廣西憑祥 532600；2.南寧海關(guān)，廣西南寧 530029；3.東興海關(guān)，廣西東興 538100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬烈性傳染病。該病2018年8月首次發(fā)現(xiàn)于我國(guó)遼寧省，隨后疫情從東北地區(qū)迅速蔓延至全國(guó)各地，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。2019年2月20日，越南向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）首次報(bào)告發(fā)生ASF疫情，其后疫情席卷越南全境。與越南毗鄰的我國(guó)廣西也于2019年2月發(fā)生了首例ASF疫情。蜱在ASFV傳播過程中扮演著重要角色。ASFV可在鈍緣蜱屬（Ornithodoros）的軟蜱體內(nèi)復(fù)制，從而使蜱成為病毒的儲(chǔ)存庫(kù)，經(jīng)叮咬可引起豬感染[1]。據(jù)劉建等[2]推測(cè)，軟蜱最適生長(zhǎng)溫度為22～30 ℃，最適濕度為75%～95%。廣西屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，全年平均氣溫為16.5～23.1 ℃，雨水豐沛，季節(jié)變化不明顯，很適合蜱繁殖。目前關(guān)于廣西蜱種類的報(bào)道始見于廖國(guó)厚等[3]的硬蜱調(diào)查，但至今未見關(guān)于軟蜱的報(bào)道。鑒于ASFV可在蜱體內(nèi)長(zhǎng)期存在，而且可在野豬-蜱-家豬三者間循環(huán)傳播，因而不能忽視蜱傳播ASFV的潛在風(fēng)險(xiǎn)[2]，尤其是廣西。為了解廣西中越邊境地區(qū)蜱的種類分布及其ASFV攜帶情況，開展了此次流行病學(xué)調(diào)查，以期為廣西中越邊境地區(qū)ASF防控決策提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蜱捕捉地點(diǎn)及時(shí)間

廣西地處南疆邊陲，有8個(gè)市（縣）與越南毗鄰，山水相連，沒有天然屏障。邊境線長(zhǎng)1 026 km，有194條通道可通行機(jī)動(dòng)車輛。本次蜱采集區(qū)域主要靠近中越邊境線，包括東興市馬路鎮(zhèn)、東興鎮(zhèn)、峒中鎮(zhèn)，寧明縣愛店鎮(zhèn)、桐棉鎮(zhèn)，龍州縣水口鎮(zhèn)、武德鄉(xiāng)，憑祥市友誼鎮(zhèn)、憑祥鎮(zhèn)、上石鎮(zhèn)，靖西市龍邦鎮(zhèn)、寧安鄉(xiāng)，那坡縣平孟鎮(zhèn)。捕捉時(shí)間為2019年6月—2020年11月。

1.2 蜱采集方法

1.2.1游離蜱 采用布旗法，用90 cm×60 cm的白布旗，在調(diào)查區(qū)域內(nèi)定時(shí)拖蜱。手持旗桿伸向一側(cè)，使旗子平鋪于草叢上，等速緩步前行，每步行10 m停下觀察1次，將附于旗上的蜱撿入容器內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)撿獲蜱總數(shù)，同時(shí)進(jìn)行蜱分類鑒定和ASFV核酸檢測(cè)。

1.2.2寄生蜱 采集鼠、狗、牛、羊、蝙蝠等動(dòng)物體表寄生蜱于容器內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)撿獲蜱總數(shù)，以及蜱分類鑒定和ASFV核酸檢測(cè)。

1.3 蜱分類鑒定

按《中國(guó)國(guó)境口岸病媒生物及動(dòng)物蟲媒病》[4]和《中國(guó)國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)媒生物鑒定圖譜》[5]進(jìn)行。

1.4 ASFV核酸檢測(cè)

ASFV核酸檢測(cè)，比如樣品處理、核酸提取等，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）執(zhí)行[6]。

1.4.1儀器和試劑 全自動(dòng)核酸提取儀（型號(hào)GeneRotex96），西安天隆科技有限公司提供；熒光定量PCR儀（型號(hào)Quantstudio 7 Flex），美國(guó)ABI公司提供；病毒DNA/RNA提取試劑盒（批號(hào)20082320T014、20112510T014），西安天隆科技有限公司提供；熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20191102、20200803），鄭州中道生物技術(shù)有限公司提供。

1.4.2蜱處理 將整只蜱置于組織勻漿器中充分研磨，加入1 000 IU/mL的青霉素、1 000 μg/mL的鏈霉素[7]、0.1 mol/L的滅菌PBS（pH7.4），制備10% 組織勻漿液，2 000 r/min離心處理10 min，取上清液，標(biāo)記編號(hào)，立即進(jìn)行ASFV檢測(cè)或冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3引物和探針 針對(duì)ASFVB646L基因保守序列[7]設(shè)計(jì)引物和探針。上游引物VP72-F1：5'-GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCT-3'；下游引物VP72-R1：5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3'：TaqMan探 針VP72-T1：FAMCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGBHQ1。

1.4.4核酸擴(kuò)增 按試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件：50 ℃孵育2 min；95 ℃預(yù)變性3 min；預(yù)擴(kuò)增，95 ℃變性5 s，55 ℃退火延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，95 ℃變性5 s，55 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光通道選擇FAM，在擴(kuò)增階段每個(gè)循環(huán)的55 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為25 μL，同時(shí)選擇passive reference和quencher為none模式。

1.4.5結(jié)果判定（1）基線和閾值設(shè)定?；€調(diào)整取6～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定以閾值線剛好過陰性對(duì)照檢測(cè)熒光曲線的高點(diǎn)為原則。（2）質(zhì)量控制。陰性對(duì)照應(yīng)無特定擴(kuò)增曲線，且Ct ＞38.0或無；陽性對(duì)照Ct ≤30.0，且擴(kuò)增曲線明顯；否則試驗(yàn)視為無效。（3）樣品判定。待檢樣品熒光信號(hào)有指數(shù)型增加，且Ct ＜35.0，為陽性；未檢測(cè)到Ct或Ct ＞38.0或無明顯擴(kuò)增曲線，則為陰性；35.0 ≤Ct ≤38.0時(shí)，復(fù)檢1次，復(fù)檢結(jié)果為陽性則判定為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 蜱分類鑒定

共捕捉蜱222只，經(jīng)分類鑒定屬于2科5屬8種；區(qū)域分布廣泛，優(yōu)勢(shì)種為微小牛蜱和粒形硬蜱。222只蜱中，有7種硬蜱，只有1種軟蜱且只在蝙蝠身上捕捉到（表1）。部分蜱種鑒定照片見圖1。

表1 蜱采樣地點(diǎn)、數(shù)量及鑒定情況匯總

圖1 部分蜱種鑒定照片

2.2 ASFV核酸檢測(cè)

所有的222只蜱，經(jīng)熒光PCR方法檢測(cè)，均為ASFV核酸陰性（圖2）。

圖2 222只蜱的ASFV核酸檢測(cè)結(jié)果

3 討論

ASF是由蟲媒雙鏈DNA的ASFV引起豬高死亡率的病毒性疫病，自2018年8月傳入我國(guó)以來，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)對(duì)防控ASF十分重視，出臺(tái)了多條政策，實(shí)施各種措施提高ASF防控能力，控制ASF的肆意傳播，取得了階段性效果。到2020年底，我國(guó)生豬產(chǎn)能已恢復(fù)到2017年底的90%以上。由于目前尚未有ASFV疫苗，因此防控ASF形勢(shì)仍然嚴(yán)峻。

據(jù)報(bào)道[8]，ASFV可在蜱體內(nèi)持續(xù)存活幾個(gè)月到5年。軟蜱科中的鈍緣蜱屬（Ornithodoros）是ASFV極為重要的自然宿主和儲(chǔ)存宿主[9]。此類蜱叮咬了被ASFV感染的豬時(shí)便會(huì)攜帶此病毒，當(dāng)其再次吸血時(shí)就會(huì)導(dǎo)致該病傳播。歷史上，在ASF傳播中，鈍緣蜱擔(dān)當(dāng)了重要角色[10]。比如，20世紀(jì)60年代，西班牙和葡萄牙的ASF疫情流行中，軟蜱充當(dāng)了重要的媒介和儲(chǔ)存宿主作用[11-12]。軟蜱壽命很長(zhǎng)，有資料介紹可生存20年，大多數(shù)ASFV野毒株可在軟蜱體內(nèi)持續(xù)存活，可長(zhǎng)達(dá)8年甚至終生[10]。一旦ASFV侵入蜱的生存循環(huán)圈，將對(duì)家豬帶來長(zhǎng)期威脅，難以根除。1957年ASF傳入葡萄牙，直到1993年底才被凈化，歷時(shí)36年。1999年11月，葡萄牙南部Alentejo省一農(nóng)場(chǎng)復(fù)發(fā)ASF疫情。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，疫情發(fā)生是因豬舍內(nèi)游走的鈍緣蜱，而這距離最后一次疫情將近6年時(shí)間[13]。經(jīng)對(duì)葡萄牙暴發(fā)的ASF疫情進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)撲滅疫情后2.50～5.25年仍有8.8%的豬場(chǎng)存在感染ASFV的蜱[13]。

廣西蜱種類繁多，據(jù)報(bào)道[3]，已發(fā)現(xiàn)6屬11種：爪哇花蜱（Am.javanense）、巴 氏盲花蜱（Ap.barbouri）、厚體盲花蜱（Ap.crassipes）、微小牛蜱（B.microplus）、緬甸血蜱（H.birmaniae）、具角血蜱（H.cornigera）、嗜鳥血蜱（H.ornithophila）、粒形硬蜱（I.granulatus）、卵形硬蜱（I.ovalus）、鐮形扇頭蜱（R.haemaphysaloides）、短小扇頭蜱（R.pumilio）。此次調(diào)查于蝙蝠上捕捉到了蝙蝠銳緣蜱，表明廣西中越邊境地區(qū)有軟蜱分布，但沒有捕捉到傳播ASFV風(fēng)險(xiǎn)較高的鈍緣蜱。今后要擴(kuò)大蜱的捕捉區(qū)域，爭(zhēng)取捕到更多的屬種，以確定廣西蜱的種類分布。本次調(diào)查捕捉到的蝙蝠銳緣蜱的ASFV傳播作用，有待今后進(jìn)一步研究。

本次調(diào)查未在捕捉到的蜱中檢測(cè)到ASFV，但廣西和越南家豬中存在ASF疫情，且中越邊境線上有一些散養(yǎng)的野豬與家豬雜交品種。這些雜交品種豬都是放養(yǎng)的，是實(shí)際意義上的叢林豬，和野豬生境差不多，因此存在病毒進(jìn)入此循環(huán)圈的風(fēng)險(xiǎn)，今后需要繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)這些豬群及蜱的ASFV監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西中越邊境地區(qū)以硬蜱分布為主，但也存在軟蜱；雖然未在捕獲的蜱中檢出ASFV，但鑒于該地區(qū)疫情形勢(shì)、家豬養(yǎng)殖模式以及野豬分布，蜱在ASFV傳播和儲(chǔ)存方面的潛在風(fēng)險(xiǎn)依然存在。因此，需要進(jìn)一步擴(kuò)大區(qū)域，繼續(xù)開展蜱的調(diào)查及其ASFV攜帶情況監(jiān)測(cè)。