陳錦芬，顧開元，賈雨豪，成欣，鄒聰明，謝小玉*

1 西南大學農學與生物科技學院，重慶北碚 400715；

2 云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南昆明 650021

錳是作物生長所必須的重要元素之一，它參與了植物的光合作用、氧化還原反應及多種酶代謝過程[1]。但是，高錳脅迫下容易引發(fā)植物體內的一系列危害，包括植株生物量減少[2]，種子發(fā)芽率降低[3]，礦質元素吸收、光合系統(tǒng)[4]及抗氧化酶系統(tǒng)[5]紊亂。因此，高錳脅迫成為我國農業(yè)生產的重要限制因素。煙草是我國西南地區(qū)的重要經濟作物，該地區(qū)多為酸性土壤，部分地區(qū)有效錳含量極豐富，易引起錳過量癥[6]。已有研究表明，錳過量脅迫會引起生理性中毒，并最終對烤煙外觀質量與內在品質造成不良影響[7]。因此減輕高濃度錳脅迫對植物的危害具有十分重要的意義。

已有研究表明，施加外源水楊酸[8]及甜菜堿[9]對植物重金屬脅迫有緩解作用。水楊酸是一種植物體內重要的酚類物質，施加外源水楊酸可以提高植物的抗逆能力[10]。外源水楊酸可以促進NaCl脅迫下葉片中光合色素的合成，從而促進了葉片光合作用[11]；王小紅等[8]研究發(fā)現(xiàn)施加外源水楊酸可以顯著提高鎘脅迫下抗氧化酶的活性，并顯著降低鎘脅迫下對抗氧化酶活性的抑制作用；張曉等[12]認為，水楊酸可以促進鎘脅迫下幼苗的生長并降低鎘在其體內的積累。

甜菜堿是一種滲透保護劑，它廣泛存在于動植物體中，可幫助植物抵御逆境帶來的傷害[13]。根施外源甜菜堿可以提高胡楊葉片的耐鹽力；在對煙草的研究中也發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可以降低其對鎘的吸收及積累，從而減緩鎘的毒害作用[14]。

目前，已有許多關于外源物質對煙草鎘脅迫的緩解的研究，但是對于錳脅迫的研究還未見報道。因此，本研究以煙草紅花大金元為試驗材料，采用盆栽試驗方法探究高錳脅迫對煙草生理特性的影響及外源水楊酸、甜菜堿對煙草抗氧化系統(tǒng)及錳積累的影響，以期探明煙草生產中錳脅迫緩解的生理機制及緩解錳脅迫的最適水楊酸和甜菜堿濃度，為解決生產中煙草錳脅迫問題提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗設計

試驗于2019 年4 月至8 月在西南大學2 號溫室進行。將煙草種子播種于育苗盤中，培養(yǎng)至4葉1心時，選取長勢一致、無病害的煙苗移栽至裝有8 kg壤土的花盆中，按照常規(guī)方式供給水肥。盆底放置托盤以防根系伸出，待煙草長至旺長期時開始進行脅迫處理。每處理三重復，每重復3盆，每盆留1株煙苗。于早上9：00～ 10：00對每盆煙苗根灌以MnSO4·H2O配成的Mn2+含量為500 mg/kg（根據(jù)前人研究結果與前期預備試驗篩選）的水溶液1L，對照組（CK）以等量蒸餾水代替，共澆灌3次，每兩次之間間隔一周；在第3次脅迫處理后的第3天，開始進行緩解處理（在前期預實驗基礎上分別篩選出4個濃度梯度），即在每天早上9：00～ 10:00分別根灌水楊酸（SA）和甜菜堿（GB）溶液200 mL，對照（CK）及錳脅迫對照（CK1）根灌等量蒸餾水。每天1次，共澆3天，3天后取自上而下第4～6片葉剪碎混勻用以測定相關指標。

試驗采用隨機區(qū)組方法，共有10個處理，具體試驗設計見表1。

表1 試驗設計Tab. 1 Test design

1.2 測定項目及方法

1.2.1 最大葉長葉寬測定

1.2.2 錳含量測定

取部分混勻后的葉片，置105℃的烘箱中殺青30分鐘后于80℃中烘至恒重。然后用粉碎機粉碎過0.2 mm篩。稱取0.5 g樣品加入7.5 mL濃硝酸和1.5 mL高氯酸，混勻后進行消解，得到白色透明的消化液后用去離子水洗入50 mL容量瓶并定容，使用原子分光光度儀（AA7000，島津）測定錳含量[16]。

1.2.3 生理指標測定

稱取部分混勻后的葉片0.2 g剪碎，置于20 mL去離子水中，真空抽提2～3次，在20℃～25℃恒溫下用電導儀測定電導率T1，測完再放入100℃沸水中水浴30 min，取出后自然冷卻至室溫測定煮后電導率T2，相對電導率（REC）= T1/ T2×100%。

在模塊化、定制化設備和服務中，存在大量可重復使用和重新組合使用的單元.通過采用標準化、系列化、通用化的方法,充分挖掘和利用這些單元,將定制設備的生產問題，通過設備重組和過程重組,全部或部分轉化為批量生產的問題,從而以較低的成本、較高的質量和較快的速度生產出個性化設備.

丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）活性分別采用氮藍四唑法、愈創(chuàng)木酚法及紫外吸收法測定；可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（SS）和脯氨酸（Pro）含量分別采用考馬斯亮藍G-250法、蒽酮比色法和磺基水楊酸法測定[17-18]；過氧化氫（H2O2）及超氧陰離子產生效率采用試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司生產）測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2010和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析。采用鄧肯（Duncan’s）法進行方差分析，采用皮爾遜（Pearson）法進行相關性分析。采用隸屬函數(shù)值法對錳脅迫緩解程度進行分析：當外源緩解物質的施用與該指標測定值呈正相關時，選用公式：Z(i)=（Zi- Zmin）/（Zmax- Zmin），呈負相關時則選用公式：Z(i)=1-（Zi - Zmin）/（Zmax- Zmin）。式中：Z(i)為某系列指標的隸屬值，Zi為某系列指標的測定值，Zmax為該系列指標測定的最大值，Zmin則是最小值，最后取所有指標的平均值即為該處理的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對煙草最大葉長葉寬的影響

圖1表明，錳脅迫（CK1）下最大葉長、葉寬均顯著降低。施加外源水楊酸及甜菜堿后最大葉長的變化不明顯；經外源緩解物質處理后S2、S3的最大葉寬最大，較CK1分別增加了26.09%及28.26%，差異達到顯著水平。

圖1 不同處理對煙草葉片最大葉長、葉寬的影響Fig. 1 Effect of different treatments on maximum length and width of tobacco leaves under manganese stress

2.2 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對煙草錳含量的影響

圖2表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的錳含量增加了14.8倍。施加外源緩解物質后的各處理葉片中的錳含量下降。其中G3和S2處理下的錳含量最低，即當外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時，對煙草錳脅迫的緩解效果最好。

圖2 不同處理對煙草葉片錳含量的影響Fig. 2 Effect of different treatments on manganese content of tobacco leaves under manganese stress

2.3 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對煙草中相對電導率及丙二醛含量的影響

圖3表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的相對電導率及丙二醛含量分別增加了115.74%和48.85%。相對于錳脅迫處理，施加外源物質后二者均降低，其中G3處理和S2處理煙葉的相對電導率分別降低了25.50%和29.82%、丙二醛含量分別降低了29.92%及31.38%達到最低水平。

圖3 不同處理對煙草中相對電導率及丙二醛含量的影響Fig. 3 Effect of different treatments on relative electrical conductivity and MDA content of tobacco leaves under manganese stress

2.4 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對3個抗氧化酶活性的影響

圖4表明，錳脅迫（CK1）下煙草葉片的抗氧化酶活性均顯著提高，施加外源緩解物質后活性受到抑制。當外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L時，SOD及CAT活性最低，POD則是在G4水平活性最低；當外源水楊酸濃度為200 mg/L時，SOD及POD活性受到抑制的程度最大，而CAT活性在濃度為150 mg/L時最低，較CK1降低了34.46%，達到最低水平。

圖4 不同處理對煙草中抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effect of different treatments on antioxidant enzyme activity of tobacco leaves under manganese stress

2.5 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量的影響

圖5表明，錳脅迫處理（CK1）會使?jié)B透調節(jié)物質含量增加，施加外源物質后下降。當外源甜菜堿濃度為0.15 mol/L時，可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的下降幅度最大，分別降低了11.91%、43.28%及33.93%達到最低，與CK1差異顯著；三者的含量隨外源水楊酸濃度變化差異較大，其中可溶性蛋白在水楊酸濃度為100 mg/L時含量最低且呈現(xiàn)隨濃度升高含量逐漸上升的趨勢，可溶性糖含量在S4處理時含量達到最低，當水楊酸濃度為150 mg/L時脯氨酸含量最低，較CK1顯著降低25.33%。

圖5 不同處理對煙草中可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the contents of soluble protein, soluble sugar and proline in tobacco leaves under manganese stress

2.6 不同濃度的外源甜菜堿及水楊酸對H2O2含量及O2-產生速率的影響

圖6表明，錳脅迫處理（CK1）使煙草葉片的過氧化氫含量及超氧陰離子產生效率顯著提高，施加外源物質后則降低。當外源甜菜堿濃度為0.25 mol/L時過氧化氫含量達到最低，不同濃度外源水楊酸處理下，過氧化氫含量差異不顯著；施加外源物質后超氧陰離子產生速率顯著降低，其中當外源甜菜堿濃度為0.15 mol/L，外源水楊酸濃度為150 mg/L時，產生速率達到最低。

圖6 不同處理對H2O2含量及O2-產生速率的影響Fig. 6 Effect of different treatments on H2O2 contents and O2 production rate of tobacco leaves under manganese stress

2.7 最佳緩釋劑濃度篩選

采用隸屬函數(shù)分析結果表明（表2），各指標中綜合評價值排名第1和第2的是S2和G3，即當外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L，外源水楊酸濃度為150 mg/L時緩解效果最好。

表2 不同處理對錳脅迫緩解的綜合評價Tab. 2 Comprehensive evaluation of manganese stress mitigation under different treatments

2.8 各生理指標與錳含量的相關性分析

煙草葉片的錳含量（Mn）可以反映其錳脅迫的程度，對煙草錳積累量和各指標進行相關性分析，結果（表3）表明，錳含量（Mn）與相對電導率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及脯氨酸（Pro）含量呈極顯著正相關，與過氧化氫酶活性（CAT）、可溶性蛋白（SP）及可溶性糖含量（SS）、過氧化氫（H2O2）含量呈顯著正相關。即在錳脅迫下可通過測定相對電導率、超氧化物歧化酶活性及脯氨酸含量的高低判定外源物質緩解煙葉錳脅迫的情況，這3個指標測定值越高，錳對煙葉的脅迫越嚴重。

表3 錳含量與各生理指標之間的皮爾遜相關系數(shù)Tab. 3 Pearson correlation coefficients between Mn content and physiological indexes

3 討論

3.1 外源甜菜堿及水楊酸對煙葉最大葉長、葉寬的影響

肖澤華等[3]研究發(fā)現(xiàn)，錳對黃花草幼苗生長有高抑低促的作用，且較高濃度的錳脅迫濃度會顯著降低其生物量的產生。在本試驗條件下，根灌3次500 mg/kg的錳會顯著降低煙草葉片的最大葉長及葉寬值，這與他們的研究結果一致。施加甜菜堿及水楊酸后，最大葉長葉寬的增長量與CK1相比并不十分顯著，這可能是因為外源物質的施用與取樣所間隔的時間較短，所以變化并不明顯。

3.2 外源甜菜堿及水楊酸對錳含量的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，施加外源水楊酸[20]及甜菜堿[21]可以降低重金屬的毒性。金政等[19]通過研究也發(fā)現(xiàn)隨著錳離子濃度的升高，西南木荷植株的錳含量也會逐漸升高；Shi等[22]發(fā)現(xiàn)施用外源水楊酸可以降低黃瓜葉片中錳離子的積累，這可能是因為水楊酸可以調節(jié)離子的跨膜運輸[23]，從而抑制了錳離子在植株體內的積累。在本試驗條件下，本試驗研究表明，高錳脅迫使煙草錳含量顯著提高，施加水楊酸及甜菜堿會顯著降低煙草中的錳含量，這與孟德佳[18]等的研究結果一致。

3.3 外源甜菜堿及水楊酸對相對電導率及丙二醛含量的影響

在本研究中，高錳脅迫使煙草葉片中的相對電導率及丙二醛含量顯著上升，這與袁滿[24]等的研究一致。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源施加甜菜堿及水楊酸可以顯著降低脅迫下植株葉片中相對電導率及丙二醛含量[25-27]，本研究也證實了這一點。此外，在本試驗條件下，隨著外源甜菜堿及水楊酸濃度的升高，相對電導率及丙二醛含量先下降后升高，這與錳積累量的變化規(guī)律一致，這說明外源物質在較低濃度水平下可緩解錳的脅迫，但是過高的濃度依然有可能會對植物造成另一種脅迫。其中，在G3及S2處理相對電導率及丙二醛含量均達到最低，這與隸屬函數(shù)分析的結果一致。

3.4 外源甜菜堿及水楊酸對三個抗氧化酶活性的影響

在本研究中，與CK相比，遭受錳離子脅迫的CK1處理的抗氧化酶活性均顯著提高，這可能是因為逆境下植物中活性氧含量會上升，從而激活了體內的抗氧化系統(tǒng)。但是通過彭喜旭等[28]研究發(fā)現(xiàn)，雖然SOD及POD的活性會因脅迫而上升，但是不一樣的是過氧化氫酶活性在遭到脅迫后不升反降，它的這種變化可能與植物對錳脅迫所產生的分子應答有關[29]，所以還有待進一步探究。在本試驗條件下，通過根灌甜菜堿及水楊酸發(fā)現(xiàn)酶活性受到抑制，這與張曉[12]及李雷[20]等的研究結果一致，其產生的原因可能是因為外源物質的施用抑制了ROS的過度積累，所以導致抗氧化酶的活性也受到了抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，SOD及CAT活性在外源甜菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時受抑制的程度最大，說明該濃度的緩解效果最好。

3.5 外源甜菜堿及水楊酸對可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，煙草滲透調節(jié)物質的含量會升高[30-32]，本研究亦證實了這一點。甜菜堿和水楊酸均是重要的滲透調節(jié)物質，我們發(fā)現(xiàn)，外源施加這兩種物質可以有效降低滲透調節(jié)物質的含量，且總體呈現(xiàn)出在低濃度效果更佳的趨勢，這可能是因為它們的施入使細胞滲透勢下 內任何物質含量的變化都是由許多不同的代謝共同影響的，所以導致了三種滲透調節(jié)物質的變化規(guī)律并不完全一樣，這與后有麗等[33]的研究結果一致。其中，可溶性蛋白及脯氨酸含量均在濃度0.15 mol/L甜菜堿及濃度150 mg/L水楊酸處理下達到最低，這與隸屬函數(shù)分析結果一致。

3.6 外源甜菜堿及水楊酸對H2O2含量及O2-產生速率的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，當植物受到脅迫時，體內會積累大量的活性氧[35]，所以當煙草受到錳脅迫的時候，H2O2含量及O2-產生速率顯著提高，這會對其造成損傷，但是施加了外源物質以后ROS的含量明顯降低，說明對ROS的產生有一定的抑制作用。在本試驗條件下，研究發(fā)現(xiàn)通過對煙草進行錳脅迫會使其H2O2含量及O2-產生速率顯著提高，但是施加了甜菜堿及水楊酸以后會略有下降，這與Su等[34]通過利用乙酰膽堿對煙草鎘脅迫進行緩解的研究結果一致。

4 結論

錳脅迫會對煙草產生毒害作用，施加甜菜堿及水楊酸可以明顯緩解高錳傷害。當甜外源菜堿濃度為0.20 mol/L、外源水楊酸濃度為150 mg/L時，錳含量、相對電導率顯著降低，抗氧化酶活性也得到了抑制，滲透調節(jié)物質及過氧化氫含量顯著降低，對于高錳脅迫有明顯的緩解作用。