張鴿，李志豪，鄧帥軍，李東亮，張良，蔡斌，向小華，王娟，王帆，陳國強，張海波*，劉好寶*,,4

1 中國科學院大學研究生院，中國科學院青島生物能源與過程研究所，生物基材料重點實驗室，山東青島 266101；

2 中國農業(yè)科學院煙草研究所，農業(yè)部煙草生物學與加工重點實驗室，山東青島 266101；

3 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?，海口 571100；

4 青島農業(yè)大學農學院，山東青島 266109；

5 四川中煙工業(yè)有限責任公司，成都 610000

雪茄煙是一種特殊的煙草制品，傳統(tǒng)概念上是指全部用煙葉卷成的煙卷，其香氣醇厚，吃味透甜、濃度大[1]。經典的雪茄煙通常由茄衣（外包皮）、茄套（內包皮）和茄芯（芯葉煙）組成[2]。雪茄煙生產中，發(fā)酵是保證雪茄煙葉品質形成的關鍵環(huán)節(jié)，是改善雪茄煙葉外觀質量、物理特性、內在化學成分、吸食品質的重要工序，被稱為雪茄煙葉生產的技術核心[2-6]。

雪茄煙葉常見的堆垛發(fā)酵一般要經歷初分級、回潮、堆垛、翻垛、重新碼堆等幾個重要過程[2]。微生物在雪茄煙葉發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。19世紀80年代，小什列晉格提出微生物作用假說[7]，近年關于微生物在煙葉發(fā)酵中作用的研究逐漸深入，包括煙葉發(fā)酵中微生物群落的表征[8-10]、微生物在煙葉發(fā)酵提質增香中的作用[11-12]等。研究顯示，細菌在煙葉發(fā)酵品質改善中發(fā)揮重要作用[4]，但雪茄煙葉發(fā)酵過程中細菌群落多樣性、動態(tài)演替規(guī)律以及細菌群落在發(fā)酵中的作用尚不明確，有待進一步深入研究。本研究以海南省H382品種雪茄煙葉為實驗材料，通過16S rRNA測序技術，在實驗室條件下模擬人工發(fā)酵，對發(fā)酵過程中雪茄煙葉的細菌群落多樣性和群落演替進行表征，并預測分析發(fā)酵過程中細菌的功能，期望為揭示雪茄煙葉微生物發(fā)酵機理提供理論參考，為篩選雪茄煙葉發(fā)酵功能細菌提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015—2016年度海南省樂東縣抱由鎮(zhèn)種植的雪茄煙葉中部煙葉，供試品種為H382。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪茄煙葉發(fā)酵及取樣

（1）煙葉回潮

將雪茄中部煙葉按照30～35片/把的標準進行扎把，扎把后按相鄰煙把間隔10～15 cm懸掛于回潮房內，在相對濕度75%～85%、溫度25℃～27℃、回潮時間為8～10 h的條件下，進行霧化回潮處理[13]，回潮期間翻動煙把，保證煙葉回潮均勻，最終使煙葉含水量控制在25%～35%范圍，作為待發(fā)酵實驗樣品。

（2）煙葉發(fā)酵及取樣記錄

將回潮好的煙葉置于自封袋中，裝煙規(guī)格為6.0 kg，排掉自封袋中空氣，將自封袋置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中溫度和濕度參數(shù)設定詳見表1。按表1中溫度濕度控制進行實驗，每完成1個升溫過程（28℃±1℃～50℃±1℃），為1個發(fā)酵周期，共進行6個發(fā)酵周期。每個發(fā)酵周期結束后取樣200 g，包括初始樣（YB_1），第1次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_2），第2次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_3），第3次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_4）、第4次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_5）、第5次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_6）及第6次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_7）。取樣保證均勻，取樣樣品在液氮下研磨粉碎，混合均勻，取1.0 g±0.1 g作為細菌群落檢測樣本，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(http://www.majorbio.com/）檢測。

表1 恒溫恒濕培養(yǎng)箱中溫度濕度變化程序設置表Tab. 1 The program of temperature and humidity in incubator

1.2.2 HTS 測序

微生物菌體收集、基因組提取、PCR擴增、文庫構建及上機測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，引物選用799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′），1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′），測序區(qū)域為V5-V7區(qū)域[9,14]。

1.2.3 生物信息學分析

（1）OTUs聚類：以97%的相似水平對OTU進行聚類，保留注釋到細菌屬的OTUs，基于最小樣本序列數(shù)（34102）對OTU抽平。

（2）α多樣性分析：利用Mothur 1.30.2（https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）計算Alpha多樣性相關指數(shù)Shannon, simpson, Sobs, Chao1, ace,coverage。

（3）Beta多 樣 性 分 析：基 于Bray_Curtis、weighted和unweighted Unifrac距離計算距離矩陣，使用PCoA進行結果可視化展示。

（4）PICRUSt功能預測：利用PICRUSt（http://picrust.github.io/picrust/）對細菌功能進行預測分析。

2 結果分析

2.1 H382 雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序OTU數(shù)目統(tǒng)計

根據(jù)表2 可知，在H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中，OTU數(shù)目較多，細菌多樣性豐富；其中以YB_3的OTU數(shù)目最多，為222；且在發(fā)酵過程中，由YB_2到YB_3，OTU數(shù)目呈增加趨勢，YB_4，YB_5直至YB_6樣本中呈現(xiàn)減少趨勢，最后YB_7中OTU數(shù)目又有少量增加。細菌的多樣性在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增加后降低，最后略有增加，基本趨于平穩(wěn)的趨勢。

表2 發(fā)酵樣本OTU數(shù)目統(tǒng)計Tab. 2 The numbers of OTU in samples

2.2 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序結果的Alpha多樣性分析

根據(jù)coverage和以Sobs指數(shù)為代表的稀釋曲線（圖1）趨勢可知，測序結果能夠覆蓋雪茄煙葉發(fā)酵中表面細菌群落多樣性。表3結果顯示，所測樣本中，YB_1和YB_3中的Sobs指數(shù)最大，與Chao1和ace指數(shù)趨勢一致，說明YB_1和YB_3 2個樣本中的物種總數(shù)最多；shannon數(shù)值中，YB_1、YB_2、YB_3和YB_4 4個樣本中，數(shù)值相對較高，說明群落多樣性高，與simpson指數(shù)反映的結果一致。

圖1 H382雪茄煙葉發(fā)酵測序稀釋曲線Fig. 1 The rarefaction curve in fermentation samples of H382 cigar leaves

表3 細菌群落α多樣性指數(shù)表Tab. 3 The α diversity index of bacterial community

2.3 海南H382雪茄煙葉發(fā)酵過程細菌群落分析

根據(jù)表4統(tǒng)計結果可知，YB_1初始樣本中共包含27個屬，在發(fā)酵啟動的YB_2樣本中，細菌的種類及含量發(fā)生較大變化，Enterococcus、Bacillus、Oceanobacillus、Cronobacter以 及Paracoccus含 量分別由1.1%、0.63%、0.48%、0.23%和0.0088%上升至19%、9.4%、6.5%、2.9%和4.6%，提升比例分別為17.3、14.9、13.5、12.6和522.7倍，可能在H382雪茄煙葉發(fā)酵啟動中發(fā)揮重要作用。相反，

unclassified-f-Enterobacterriaceae、Methylobacterium

以及Enterobacter含量分別由11%、5.4%和2.1%降低至0.58%，0.23%，0.0059%，可能在發(fā)酵啟動中發(fā)揮作用較小。另外，Aerococcus和Georgenia在YB_2中含量接近為0，且Aerococcus在發(fā)酵過程中含量極少，在YB_4、YB_6和YB_7樣本中含量痕量，接近為0（出現(xiàn)結果為0的原因有二方面，一方面因測序中OTU是采用97%的相似度聚類，可能存在合并；另一方面測序結果按樣本最小序列數(shù)做了抽平處理，導致有數(shù)字“0”出現(xiàn)），推測其在發(fā)酵中發(fā)揮作用較??；其余細菌種類含量變化差異相對較小，其 中，Terribacillus、Cronobacter、Lysinibacillus含量有小幅度提升，可能在發(fā)酵啟動中也發(fā)揮部分作用。其余細菌種類都有小幅度降低，可能在發(fā)酵啟動中發(fā)揮作用較小。關于這些微生物在煙葉發(fā)酵中具體作用，需要后續(xù)進一步開展單個菌株的發(fā)酵驗證試驗。

在整個雪茄煙葉發(fā)酵過程中，自始至終有17個細菌屬全程貫穿整個發(fā)酵，其中Staphylococcus、Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus 4個 屬 基本呈現(xiàn)先降低后略微增加的趨勢，可能在發(fā)酵后期發(fā) 揮 較 大 作 用；Pseudomonas、Methylobacterium、

Sphingomonas、Stenotrophomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus、Aureimonas、Microbacterium和Paracoccus 11個屬基本呈現(xiàn)先增多后降低的趨勢，尤其Pseudomonas、Sphingomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus和Paracoccus7個屬，所占比例相對較大，可能發(fā)酵前期發(fā)揮的功能更明顯。Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus3個屬基本變化波動較大。另外，Staphylococcus在所有樣本中均大量存在，YB_1中含量較高，YB_2、YB_3和YB_4樣本中含量逐步降低，隨后樣本中含量大幅度增加并趨于穩(wěn)定。Staphylococcus可能在發(fā)酵前期發(fā)揮作用較小，在穩(wěn)定期及初始樣本中含量相對穩(wěn)定。

表4 屬水平上不同樣本中細菌種類、所占比例及具體OTU數(shù)目統(tǒng)計Tab. 4 The bacterial species, proportion and the number of OTUs in different samples at genus level %

在本實驗條件下，發(fā)酵過程中主要的細菌群落演替規(guī)律如圖2所示：由發(fā)酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演變?yōu)榘l(fā)酵中期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，隨后演變?yōu)镻seudomonas和Enterobacter，最后穩(wěn)定為Staphylococcus和Terribacillus。

圖2 屬水平上發(fā)酵樣本中細菌群落組成及演替柱狀圖Fig. 2 The bacterial community composition and succession histogram in fermentation samples in genus level

另外，對雪茄煙葉發(fā)酵樣本中的OTU聚類進行分組總結，結果（表5）所示，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，細菌種類所占比例大部分在0.1%～1%和1%～10%之間，雖然這部分細菌種類占比較小，但細菌種類豐富，可能在煙葉發(fā)酵中發(fā)揮較為重要作用。

表5 雪茄煙葉發(fā)酵樣本中每個占比分組統(tǒng)計中OTU數(shù)目Tab. 5 The number of OTUs in each group during fermentation of cigar leaves

2.4 樣品Beta多樣性分析

PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐標分析，可用來研究樣本群落組成的相似性，在PCoA結果中顯示為群落結構相似度高的樣本傾向于聚集在一起。

圖3中的7個點分別代表海南H382雪茄煙葉發(fā)酵中的7個樣本，兩樣本越接近，表明兩樣本物種組成相似度越高?；趗nweighted UniFrac distances的PCoA結果分析表明，7組樣本基本可分為3組，其中的YB_1和YB_2樣本相似度較高，為Ⅰ組；YB_3和YB_4樣本相似度較高，為Ⅱ組；YB_5、YB_6和YB_7 3組樣本的相似度較高，為Ⅲ組。

圖3 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本的PCoA結果Fig. 3 The PCoA result in fermentation samples of H382 cigar leaves

2.5 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序結果PICRUSt功能預測及分組比較

16 S的直系同源簇COG（cluster of orthologous group）功能預測是通過PICRUSt[15]對OTU豐度表進行標準化，獲得OTU對應的COG家族信息，并計算各COG的豐度。根據(jù)比對到COG庫的COG編號，可以從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息及其功能信息，從而得到功能豐度譜。

根據(jù)圖4結果分析可知：不同發(fā)酵樣本中涉及的COG功能種類基本一致，但功能的相對豐度有較大差異（表6）。

圖4 發(fā)酵樣本的COG功能預測Fig. 4 The COG function prediction in fermentation samples

表6 所測發(fā)酵煙葉單一樣本中細菌功能預測統(tǒng)計表Tab. 6 Function prediction of bacterial in each fermentation sample

續(xù)表6

由圖5結果可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、3組的預測功能種類上差異較小，但功能豐度差異較大，其中以Ⅱ組豐度最高，Ⅰ組次之，Ⅲ組最低。根據(jù)預測結果可知，Ⅰ組（YB_1，YB_2）前五位可預測功能為：氨基酸運輸和代謝、碳水化合物運輸和代謝、通用功能預測、轉錄以及無機離子運輸和代謝；Ⅱ組（YB_3，YB_4）前五位可預測功能為：氨基酸運輸和代謝、通用功能預測、轉錄、碳水化合物運輸和代謝以及無機離子運輸和代謝；Ⅲ組（YB_5，YB_6，YB_7）前五位可預測功能為：通用功能預測、氨基酸運輸和代謝、轉錄、無機離子運輸和代謝和翻譯、核糖體結構和生物轉化。尤其在發(fā)酵關鍵階段中，氨基酸運輸和代謝和碳水化合物運輸和代謝功能豐度更高。

圖5 分組樣本功能預測比較分析結果Fig. 5 The comparative analysis results of function prediction in three groups

3 討論

3.1 H382雪茄煙葉發(fā)酵中細菌多樣性表征及群落演替分析

16 S rRNA高通量測序技術在表征細菌群落多樣性中應用廣泛[14,16-20]。通過對海南H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中細菌群落多樣性及演替規(guī)律進行表征，初步認識到在不同發(fā)酵時期發(fā)揮作用的主體微生物不同。根據(jù)測序結果，海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土地芽胞桿菌屬（Terribacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等細菌在雪茄煙發(fā)酵關鍵階段中的豐度較高，其中，芽孢桿菌屬占比重較高，與前期對墨西哥雪茄煙葉中的微生物種類研究基本相同，但含量略有差異[9]。海洋芽孢桿菌屬、土地芽孢桿菌屬、副球菌屬以及腸桿菌屬等菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵中均為首次發(fā)現(xiàn)，為研究雪茄煙葉發(fā)酵微生物多樣性及功能提供了新的依據(jù)。海洋芽孢桿菌、土地芽胞桿菌屬及芽孢桿菌屬生理特性豐富多樣，能分泌淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等[21,22]，推測其在煙葉發(fā)酵大分子物質降解中發(fā)揮重要作用[23-26]。煙葉中果膠物質不完全燃燒會形成甲醇，并進一步氧化成甲醛、甲酸等[27]，增加煙葉風險，并且研究表明，煙葉中果膠含量會影響烤煙的柔韌性[28]，在雪茄外包皮煙葉（茄衣）研究中，適度降解煙葉中果膠物質含量，可能會有助于提升雪茄外包皮煙葉（茄衣）的韌性，改善茄衣的物理特性。此外，烤煙中研究發(fā)現(xiàn)纖維素不完全燃燒會使煙葉刺激性增大，產生嗆咳感[29]，根據(jù)功能預測，推測芽孢桿菌屬可能在降低雪茄煙葉刺激性、改善雪茄煙葉品質中發(fā)揮作用。假單胞菌屬在尼古丁降解[30,31]方面研究較多，有可能在調整煙葉勁頭，改善上部煙葉品質上具有重要作用。劉燕等[32]研究發(fā)現(xiàn)副球菌具有脫氮反硝化特性，馬永見等[33]研究發(fā)現(xiàn)副球菌屬具有鄰苯二價酸酯降解特性，鞘氨醇單孢菌在生物降解方面[34,35]具有重要作用。值得關注的是，葡萄球菌屬的存在與前期墨西哥雪茄煙葉表面細菌群落結果和較早關于雪茄發(fā)酵中的結果[4,9]一致，但關于葡萄球菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用還未進行深入研究。

將微生物的功能研究進行分類整理，對挖掘其在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用具有指導意義，但微生物生長環(huán)境不同，代謝活動也有差異，具體在雪茄煙葉發(fā)酵中如何發(fā)揮作用，需要進一步驗證。且雪茄煙葉的微生物發(fā)酵是混菌發(fā)酵的過程，細菌的功能研究不能僅僅局限在單一菌群的作用中，混菌的研究及使用在雪茄煙葉發(fā)酵中更為重要，以便為雪茄煙葉的人工發(fā)酵控制提供指導。

3.2 海南H382雪茄煙葉發(fā)酵中細菌功能預測

PICRUSt分析與數(shù)據(jù)庫比對，將微生物的變化情況和生物功能聯(lián)系，能初步揭示不同樣本下細菌功能的差異[15,36]。本實驗使用PICRUSt功能預測，分析發(fā)酵過程中樣本間的功能差異，并根據(jù)PCoA結果，將相似度較高的樣本進行分組功能預測?？芍诎l(fā)酵過程中，氨基酸運輸和代謝以及碳水化合物運輸和代謝兩種功能豐度最高，尤其在Ⅱ組中，一方面可能與Ⅱ組包含的兩個樣本中所含OTU種類較豐富有關，另一方面可能由于YB_3和YB_4兩個樣本中，Oceanobacillus、Paracoccus、Pseudomonas等細菌種類所占的比例急劇增加，參與了雪茄煙葉發(fā)酵中的含碳化合物和含氮化合物的降解過程，維持菌體自身生長代謝。

將優(yōu)勢微生物與功能預測結果相結合，有利于篩選雪茄煙葉發(fā)酵過程中的功能微生物，對揭示雪茄煙葉的發(fā)酵過程和發(fā)酵機理、微生物在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用具有重要意義。但PICRUSt功能預測存在局限性，隨科技進步，后期結合宏基因組測序[36]，對篩選功能基因和功能微生物以及揭示煙葉微生物的發(fā)酵機理具有重要意義。雪茄煙葉的人工發(fā)酵是一個多周期的過程，發(fā)酵中會涉及翻堆、重新碼堆等操作[37,38]，研究雪茄煙葉的發(fā)酵機理，應結合發(fā)酵工藝，不僅對多個發(fā)酵周期進行細致研究，更需要對一個發(fā)酵周期內的關鍵點，如煙葉成分明顯發(fā)生降低或增加的點，溫度明顯增加、降低或平穩(wěn)的點等，包括結合微生物演替變化規(guī)律、酶活變化、煙葉成分及含量變化、環(huán)境因子變化以及雪茄煙葉評價進行統(tǒng)一分析，不僅更有助于揭示雪茄煙葉的發(fā)酵機理，更為人工精準控制雪茄煙葉發(fā)酵提供理論指導。

4 結論

明確了H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中細菌群落組成多樣性豐富，優(yōu)勢菌群主要為葡萄球菌屬、海洋芽胞桿菌屬、假單胞菌屬等；在本實驗條件下，發(fā)酵過程中首要的細菌群落演替規(guī)律為：由發(fā)酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演變?yōu)榘l(fā)酵中 期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，隨后演變?yōu)镻seudomonas和Enterobacter，最后穩(wěn)定為Staphylococcus和Terribacillus；細菌主要功能預測為氨基酸運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝等。本文為揭示雪茄煙葉的微生物發(fā)酵機理提供了一種新的研究思路。