張濤，顧沛雯，杜娟，陳思杰，李金，賈寶森

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

由藻界卵菌門葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）侵染引起的霜霉病是葡萄生長過程中的毀滅性病害，全世界各葡萄種植區(qū)均有發(fā)生，是葡萄生長過程中的第一大病害[1]。由于該病屬單年流行病害，具有潛育期短、再侵染頻繁、病菌繁殖率高的特點(diǎn)，雨熱同季的氣候易造成病害迅速流行，嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。葡萄霜霉菌無性繁殖產(chǎn)生的孢子囊抗逆性差、壽命短，自然條件下難以越冬。有性生殖是通過藏卵器與雄器交配產(chǎn)生厚壁卵孢子。卵孢子能夠抵抗不良環(huán)境條件，在病殘?bào)w及病田土壤中越冬，但在自然條件下，葡萄霜霉菌的卵孢子較少見。Lehoezky最早發(fā)現(xiàn)卵孢子的存在[4]，隨后Burruano等[5]、Kennelly等[6]、Hong等[7]也相繼在葡萄葉片組織中觀察到卵孢子。在國內(nèi)，劉延琳等[8]首次在陜西楊凌地區(qū)的葡萄霜霉病葉中發(fā)現(xiàn)卵孢子，隨后金恭璽等[9]采用病部研磨-過篩-離心-鏡檢的方法證明葡萄霜霉菌卵孢子在病殘?bào)w上越冬。

目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，葡萄霜霉病菌的卵孢子主要在土壤和植物病殘?bào)w中越冬。卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生的游動(dòng)孢子可滲入土壤，感染與土壤接觸的莖和葉，造成當(dāng)年葡萄霜霉病發(fā)生與流行[9-11]。在自然條件下，卵孢子一般有4種生活狀態(tài)：死亡、休眠、萌動(dòng)和萌發(fā)[12]。處于萌發(fā)狀態(tài)的卵孢子有芽管等侵入結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，可以通過顯微觀察來確定。而處于休眠、萌動(dòng)和死亡階段的卵孢子在外觀上沒有明顯區(qū)別，無法辨認(rèn)，在一定程度上阻礙葡萄霜霉病菌病原學(xué)和遺傳學(xué)的研究。雖然在一些地區(qū)發(fā)現(xiàn)葡萄霜霉菌卵孢子的存在，但未見對(duì)釀酒葡萄霜霉菌卵孢子形成及生活力的影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道，卵孢子在釀酒葡萄霜霉病的生活史和病害循環(huán)中的作用尚未達(dá)成共識(shí)。以釀酒葡萄品種‘赤霞珠’霜霉病葉為材料，在人工模擬條件下研究霜霉菌卵孢子形成和生活力的影響因素，以期為揭示葡萄霜霉病菌卵孢子萌發(fā)條件和初侵染源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試植物材料

2020年9月在寧夏志輝源石酒莊葡萄園采集的釀酒葡萄品種‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）感染霜霉病葉片。

1.1.2 供試試劑

乳酚油（生工生物工程有限公司，上海），噻唑蘭（MTT）染色劑（生工生物工程有限公司，上海），H2O2溶液（科密歐化學(xué)試劑公司，天津），冰乙酸（廣諾科技有限公司，上海），NaOH（雙雙化工有限公司，煙臺(tái)）等。

1.1.3 供試儀器

Olympus BX53熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速均漿機(jī)（常州越新儀器制造公司，江蘇），Sigma 3K 15離心機(jī)（Sigma公司，美國），RQX-250智能人工氣候箱（躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，上海）等。

1.2 影響葡萄霜霉菌卵孢子形成的因素

1.2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子觀察

參照劉紹芹等方法[13]。將霜霉病葉片的病斑部位，用無菌剪刀剪成大小為0.5 mm2的葉盤，后放置于250 mL燒杯中，加入少許乳酚油試劑，在小型控溫電熱爐上煮沸5～10 min，至葉片完全透明。以水為浮載劑，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 不同條件對(duì)葡萄霜霉病菌卵孢子形成的影響

取鏡檢無卵孢子形成的葡萄霜霉病葉在室內(nèi)人工模擬條件下進(jìn)行試驗(yàn)。采用4因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)如表1。溫、濕度處理在人工氣候箱中進(jìn)行，不同成熟度葉片分別從相同發(fā)病植株的上、中、下和底部采集，接觸物為土壤、沙土、沙子、空白。將不同成熟度的葉片置于裝有不同接觸物培養(yǎng)皿表面，于不同溫濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后鏡檢病斑位置，記錄單位面積的卵孢子數(shù)量。每處理10個(gè)葉片，重復(fù)3次。

1.3 影響葡萄霜霉菌卵孢子生活力的因素

1.3.1 卵孢子懸浮液制備

采集霜霉病葉，用無菌剪將病斑部位剪下，稱取3 g，加入pH7的磷酸緩沖液，使碎葉全部浸潤，15 min后濾掉緩沖液，置于冰箱中速凍2 h，采用高速勻漿機(jī)5000 r/min下勻漿30 min。將所得勻漿液分別通過200目、300目、600目和800目網(wǎng)篩過濾，用自來水反復(fù)清洗各個(gè)網(wǎng)篩，后用蒸餾水緩慢沖下600目和800目網(wǎng)篩上的卵孢子于50 mL離心管中，5000 r/min離心5 min，棄掉上清液，后加入少量蒸餾水定容至5 mL，備用。

表1 不同因素處理水平Table 1 Treatment levels of different factors

1.3.2 卵孢子生活力的測(cè)定

采用張艷菊等[14]的噻唑蘭（MTT）染色法。將制成的卵孢子懸浮液用0.05%的MTT染色劑36 ℃染色48 h，后吸取30 μL在顯微鏡下觀察。每次鏡檢100個(gè)卵孢子，3次重復(fù)，觀察并記錄死亡（黑色）、休眠（紅色）和萌動(dòng)（藍(lán)色）的卵孢子個(gè)數(shù)。

1.3.3 溫度對(duì)卵孢子生活力的影響

以室溫25 ℃為對(duì)照，共設(shè)5個(gè)溫度水平：-20、4、10、20、36 ℃。將含有卵孢子的霜霉病葉片置于不同溫度的人工氣候箱中，處理時(shí)間為1、3、7、9 d后制成卵孢子懸浮液（同1.2.1）。用MTT染色后鏡檢，并計(jì)算死亡率、休眠率和萌動(dòng)率。每次處理30片葉，重復(fù)3次。

1.3.4 濕度對(duì)卵孢子生活力的影響

以室內(nèi)濕度（RH45%）為對(duì)照，共設(shè)5個(gè)濕度水平：30%、60%、80%、90%和100%。將同期采集的霜霉病葉置于不同濕度的人工氣候箱中，處理時(shí)間分別為1、3、7、9 d，其余步驟同上。

1.3.5 pH對(duì)卵孢子生活力的影響

以pH為7的清水處理為對(duì)照，將含有卵孢子的霜霉病葉片置于pH為：4.5、5.5、6.5、7.0、8.5和9.5的溶液中，30 min后用清水沖洗葉片，其余步驟同上。

1.3.6 H2O2對(duì)卵孢子生活力的影響

以清水為對(duì)照，分別用濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的H2O2溶液處理病斑部位病葉。將葉片全部浸潤在H2O2溶液中，30 min后取出葉片，用蒸餾水反復(fù)沖洗2～3次，其余步驟同上。

1.3.7 葉組織提取液對(duì)卵孢子生活力的影響

葉組織提取液的制備：稱取10 g健康的葡萄葉片，將表面泥土等雜質(zhì)沖洗干凈，加入一定量的蒸餾水搗碎，充分研磨后過濾，取濾液，高壓滅菌30 min。以清水處理卵孢子懸浮液為對(duì)照，將葉組織提取液與卵孢子懸浮液體積比1∶1混合，分別處理1、4、7、10 d后，MTT染色，測(cè)定卵孢子的生活力狀況，重復(fù)3次。

1.3.8 土壤浸漬液對(duì)卵孢子生活力的影響

土壤浸漬液制備：采集葡萄根際土壤100 g，加100 mL蒸餾水，200 r/min振蕩2 h，過濾，收集濾液，備用。以清水處理為對(duì)照，將制備的土壤浸漬液與卵孢子懸浮液分別以體積比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，分別處理3、7、9 d后用MTT染色，測(cè)定卵孢子的生活力狀況，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Duncan氏新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析，并利用OriginPro 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子形成的觀察

利用乳酚油對(duì)病斑部位進(jìn)行透明處理，鏡檢結(jié)果表明，能夠清楚的觀察到病斑部位產(chǎn)生的卵孢子（圖1）。

MTT染色結(jié)果如圖2所示，若卵孢子被染成紅色或者紫紅色，則其處于休眠狀態(tài)（圖2A）；若為黑色或未著色，則其處于死亡狀態(tài)（圖2B）；若被染成藍(lán)色，則其正處于萌動(dòng)階段（圖2C）。

2.2 影響葡萄霜霉病菌卵孢子形成的因素

以正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定卵孢子的形成數(shù)量，結(jié)果如表2所示。溫度為10 ℃時(shí)產(chǎn)生的卵孢子最多為17個(gè)/cm2；其次是90%濕度為15個(gè)/cm2，-20 ℃沒有卵孢子形成。復(fù)合因素條件下，以10 ℃、飽和濕度（100%），與壤土接觸的中部葉片產(chǎn)生的卵孢子最多為7個(gè)/cm2；其次是10 ℃、90%濕度，與沙土接觸的上部葉片產(chǎn)生了6個(gè)/cm2。由極差大小可知，溫度＞濕度＞接觸物＞葉片成熟度，表明溫度對(duì)卵孢子的形成影響程度最大，依次為濕度、接觸物和葉片成熟度。

2.3 溫度對(duì)卵孢子生活力的影響

圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照處理（CK）相比，不同溫度處理對(duì)卵孢子生活力有顯著影響，36 ℃高溫處理萌動(dòng)率和死亡率最高，休眠率最低。處理3 d時(shí)，萌動(dòng)率最高為10%；處理9 d時(shí)，死亡率最高為22%，休眠率最低為76%。4 ℃低溫處理3 d和7 d時(shí)，休眠率最高，均為94%；死亡率均最低，均為4%；-20 ℃所有處理均無卵孢子萌動(dòng)，且隨著處理時(shí)間的延長，死亡率明顯升高。在4～10 ℃有利于卵孢子的休眠，平均休眠率超過90%以上；在4～36 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，打破休眠，卵孢子萌動(dòng)率增加，且死亡率也伴隨增加。

圖1 葡萄霜霉病菌卵孢子觀察Figure 1 Observation on oospores of downy mildew

圖2 葡萄霜霉病菌卵孢子MTT染色Figure 2 MTT staining of oospores of downy mildew of grapevine

2.5 濕度對(duì)卵孢子生活力的影響

圖4結(jié)果顯示，濕度在45%～100%時(shí)，隨著濕度的升高，萌動(dòng)率逐漸升高，休眠率逐漸降低，死亡率也有明顯降低。飽和濕度處理3 d時(shí)，萌動(dòng)率最高達(dá)12%，且死亡率最低為2%。濕度低于60%時(shí)，卵孢子死亡率普遍較高，且不利于萌發(fā)，其中以濕度為30%、處理9 d時(shí)死亡率達(dá)到最高，為23%。在60%～100%濕度范圍內(nèi)，隨著濕度增加，卵孢子萌動(dòng)率升高，而45%以下的濕度有利于卵孢子休眠，且隨著濕度減低，死亡率上升。

2.6 pH對(duì)卵孢子生活力的影響

圖5結(jié)果顯示，pH在6.5～7范圍內(nèi)有利于卵孢子存活，其中pH為6.5時(shí)，卵孢子休眠率最高為92%；pH為7時(shí)，萌動(dòng)率最高為6%，死亡率最低為4%，說明中性環(huán)境有利于卵孢子的存活和萌動(dòng)。pH高于8.5或低于5.5時(shí)，卵孢子生活力均顯著減低。其中pH 4.5時(shí)，卵孢子死亡率最高達(dá)到32%；其次是pH為9.5時(shí)，達(dá)到26%。

2.7 H2O2對(duì)卵孢子生活力的影響

圖6結(jié)果顯示，在0.5%～0.9%H2O2濃度時(shí)，隨著濃度的增加，卵孢子的萌動(dòng)率和死亡率均升高，休眠率下降。其中H2O2溶液濃度為0.9%時(shí)，卵孢子的死亡率和萌動(dòng)率最高，分別為19%和24%；休眠率最低為57%。而對(duì)照處理的休眠率最高，為91%；死亡率和萌動(dòng)率最低，分別為5%和4%。

2.8 葉組織提取液對(duì)卵孢子的生活力影響

圖7結(jié)果顯示，葉組織提取液和對(duì)照處理相比沒有顯著差異，對(duì)照處理7 d萌動(dòng)率最高為5%，休眠率和死亡率之間無顯著差異。

2.9 土壤浸漬液對(duì)卵孢子生活力的影響

由圖8可知，與對(duì)照處理相比，土壤浸漬液對(duì)卵孢子的萌動(dòng)有較為顯著的影響。當(dāng)體積比為1∶4處理3 d時(shí)，萌動(dòng)率最高為14%；處理9 d時(shí)，死亡率最高為11%。其次，體積比1∶3處理9 d，萌動(dòng)率為12%；體積比1∶1處理9 d，休眠率最高為94%；處理7 d時(shí)，萌動(dòng)率最低為2%。但各種處理對(duì)死亡和休眠的影響并不顯著。

表2 溫度、濕度、葉片成熟度、接觸物對(duì)葡萄霜霉菌卵孢子形成的影響Table 2 Effects of temperature, humidity, leaf maturity, and contact materials on oospore formation of downy mildew of grapevine

圖3 不同溫度對(duì)釀酒葡萄卵孢子生活力的影響Figure 3 Effect of different temperatures on the viability of wine grape oospores

圖4 不同濕度對(duì)卵孢子生活力的影響Figure 4 Effect of different humidity on the viability of oospores

圖5 不同pH對(duì)卵孢子生活力的影響Figure 5 Effect of different pH on the viability of oospores

圖6 不同濃度H2O2對(duì)卵孢子生活力的影響Figure 6 Effect of different concentrations of H2O2 on the viability of oospores

圖7 葉組織提取液對(duì)卵孢子生活力的影響Figure 7 Effect of leaf tissue extract on the viability of oospores

圖8 土壤浸漬液對(duì)卵孢子生活力的影響Fig 8 Eeffect of soil maceration extract solution on the viability of oospores

3 討論

目前國內(nèi)釀酒葡萄霜霉病的研究主要集中在病害發(fā)生危害、綜合防治、寄主抗性及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)等方面[1,15]。有關(guān)生物特性研究也主要針對(duì)霜霉病菌無性階段的孢子囊，而對(duì)病原菌有性階段的卵孢子研究較少。對(duì)影響卵孢子形成、萌動(dòng)及存活能力因素的研究尚未見報(bào)道，所以卵孢子在生活史和病害循環(huán)中的作用尚不完全清楚。通過對(duì)‘赤霞珠’葡萄霜霉病菌卵孢子形成影響因素的研究表明，依影響程度排序?yàn)闇囟龋緷穸龋窘佑|物＞葉片成熟度。在10 ℃、飽和濕度下，與壤土接觸的中部葉片產(chǎn)生的卵孢子最多為7個(gè)/cm2。這與張艷菊等[14]的結(jié)果相似，說明在人工模擬條件下，采用寄主組織法在適宜的條件下能夠獲得霜霉病菌的卵孢子。

近年來，MTT染色法已被廣泛應(yīng)用于卵孢子活性檢測(cè)中。Xavier等[16]利用MTT法首次對(duì)櫟樹猝死病菌（Phytophthora ramorum）卵孢子生活力進(jìn)行測(cè)定。在國內(nèi)，文景芝等[17]和張艷菊等[14]將其用于大豆疫霉（Phytophthora）和黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）卵孢子生活力檢測(cè)。研究利用MTT法首次對(duì)釀酒葡萄霜霉病菌卵孢子的生活力進(jìn)行測(cè)定，證明MTT染色劑能準(zhǔn)確反映卵孢子生活力狀況，是一種效果良好的細(xì)胞活性指示劑。

卵孢子是葡萄霜霉病菌抵御不良環(huán)境的一種生存機(jī)制，可以在土壤中存活2年甚至更長時(shí)間[7]。自然條件下，葡萄霜霉病菌卵孢子在形成后需要經(jīng)歷一段時(shí)間的休眠，在一定的外界刺激后，才會(huì)由休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)入萌動(dòng)狀態(tài)[17]。對(duì)卵孢子生活力研究發(fā)現(xiàn)，溫度、濕度、pH、過氧化物和土壤浸漬液等對(duì)卵孢子的萌動(dòng)都有一定影響。Toffolatti等[18]研究認(rèn)為，溫度是決定卵孢子萌動(dòng)和萌發(fā)速率的主要限制因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在4～25 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，萌動(dòng)率也隨之升高，說明一定的高溫刺激可有效打破卵孢子的休眠，溫度過低則會(huì)抑制卵孢子萌動(dòng)。濕度在60%以下不利于卵孢子的萌動(dòng)，同時(shí)隨著處理時(shí)間的增長死亡率也逐漸升高，說明水分是影響卵孢子長期存活的重要因素，且較高的濕度更有利于卵孢子萌動(dòng)，這與Burruano和Ciofalo等[19]研究結(jié)果基本一致。一定濃度的過氧化物可有效打破卵孢子的休眠，促進(jìn)萌發(fā)，但濃度過高也會(huì)導(dǎo)致卵孢子死亡。因此可在葡萄霜霉菌卵孢子打破休眠后，應(yīng)用此法促進(jìn)卵孢子萌發(fā)，為今后卵孢子萌發(fā)和侵染試驗(yàn)及其生理和生化特性研究奠定基礎(chǔ)。此外，過酸性或過堿性的環(huán)境不利于卵孢子萌動(dòng)和休眠，還會(huì)導(dǎo)致卵孢子的迅速死亡。這可能是因?yàn)樵谒嵝院蛪A性環(huán)境中，卵孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的功能被破壞，使有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致卵孢子失活[19]。土壤浸漬液可明顯提高卵孢子的萌動(dòng)率，這可能與葡萄根際土壤中所含的Ca2+有關(guān)。Berridge等[20]認(rèn)為，影響卵孢子萌動(dòng)的因素除了溫度、濕度等外，還與環(huán)境中的Ca2+密切相關(guān)。Ca2+進(jìn)入卵孢子細(xì)胞內(nèi)可以激發(fā)相應(yīng)生理過程酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)卵孢子萌動(dòng)。但目前有關(guān)Ca2+作為外源誘因激發(fā)卵孢子萌動(dòng)的機(jī)理還需要深入研究。

4 結(jié)論

溫度和濕度對(duì)卵孢子的形成有明顯影響，采用寄主組織法在適宜的條件下能夠獲得霜霉病菌的卵孢子，同時(shí)較高的溫濕度、一定濃度的過氧化物和土壤浸漬液對(duì)卵孢子的萌動(dòng)有促進(jìn)作用。此次研究對(duì)卵孢子的生理生化特性有了初步了解，明確了促進(jìn)卵孢子形成和萌動(dòng)的一些基礎(chǔ)因素，為后續(xù)開展卵孢子萌發(fā)試驗(yàn)及初侵染來源研究奠定了基礎(chǔ)。