陳爍，李莎莎，駱強偉，徐炎*，王躍進*

（1. 西北農(nóng)林科技大學園藝學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊陵 712100；2. 新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

葡萄的質(zhì)量和營養(yǎng)成分以及無核葡萄新品種的育種一直是重要的研究課題[1-2]。無核葡萄因其滋味甜美、即采即食等原因成為消費者選擇鮮食水果和果脯的首選。香味是影響果實品質(zhì)的重要因素。目前，能在市場上被廣泛推廣和栽培的無核且具有香味的葡萄品種還非常有限，因此將無核和香味兩個性狀疊加于一體的新品種是葡萄育種研究中的重要目標。玫瑰香味是葡萄品種獨特的氣味，該香氣與萜類化合物質(zhì)的存在有關(guān)，尤其是由于芳樟醇、香葉醇、橙花醇、香茅醇和a-萜品醇等萜類化合物的成分在香味葡萄中濃度較高，是調(diào)控香味的主要物質(zhì)[3-4]。在植物中已鑒定出兩種獨立的萜類化合物合成途徑：萜胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway, MVA）和質(zhì)體的2-甲基D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（Methyl-erythritol-4-phosphathway,MEP），而MEP途徑被認為是葡萄果肉中單萜底物生物合成的主要途徑[5]。MEP合成途徑前期的關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（HDR）共同作用生成所有萜類化合物的前體，異戊烯基二磷酸（Isopentenyl pyrophosphate, IPP）及其異構(gòu)體二磷酸二甲基烯丙酯（Imethylallul pyrophosphate,DMAPP）[6]。在合成途徑中期，IPP和DMAPP通過異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶、香葉基磷酸二氫酯合酶（gernayl diphosphate synthase, GPPS）的作用縮合，生成香葉基磷酸二氫酯（gernayl diphosphate, GPP），不同單萜合酶在晚期催化GPP轉(zhuǎn)化為環(huán)狀和非環(huán)狀單萜[7]。對葡萄基因組測序預測到一些與萜類合成相關(guān)的酶基因[8-9]，其中合成里那醇、香葉醇和a-萜品醇等萜類物質(zhì)的酶基因功能已被驗證。

果樹胚挽救的初次成功是在櫻桃中進行離體胚培養(yǎng)[10]，隨后胚挽救技術(shù)得到發(fā)展。Ramming通過離體胚培養(yǎng)成功培育了無核葡萄植株[11]。為了適應生產(chǎn)要求和育種需求的增加，胚挽救技術(shù)也在不斷完善。影響該技術(shù)的因素主要有：親本基因型、取樣時間、培養(yǎng)基成分等[12]。前人對影響胚珠發(fā)育的培養(yǎng)條件進行了研究，成功獲得胚挽救雜交苗[13-14]。王躍進等[15]利用無核葡萄胚挽救技術(shù)培育‘無核×中國野生葡萄’的胚珠，并研究了采樣時間、不同培養(yǎng)基及添加激素、接種方式對胚珠發(fā)育的影響。潘學軍[16]獲得了幼胚發(fā)育的最佳培養(yǎng)基為MM3＋10 mmol/L甘氨酸。田莉莉[17]認為，可胚挽救的母本材料對雜種胚的萌發(fā)和成苗影響較大，‘底來特’（Delight）、‘愛莫無核’（Olmo Seedless）、‘紅寶石無核’等無核品種適合在雜交中作母本，成苗率相對較低的‘無核紫’‘無核白’‘楊格爾’（Youngle）等品種不宜作母本。唐冬梅[18]通過對比取材時間認為，在一定范圍內(nèi)，較晚取材接種的胚珠成苗率較高，且通過噴施植物生長調(diào)節(jié)劑可以促進胚珠發(fā)育。賈姍姍[19]在胚萌發(fā)培養(yǎng)基WPM中添加激動素（KT）和玉米素（ZT），促進了無核香味雜種胚幼苗根的生長。

通過研究不同香味葡萄品種果實成熟期控制香味物質(zhì)的萜類合成關(guān)鍵酶基因的表達，篩選出具有萜類物質(zhì)合成酶基因高表達的香味品種作父本，以種子敗育型葡萄作母本，利用胚挽救育種技術(shù)培育無核玫瑰香味優(yōu)質(zhì)品種，為無核香味葡萄育種奠定材料基礎。通過比較親本基因型對胚挽救技術(shù)的影響，篩選與優(yōu)化胚萌發(fā)培養(yǎng)基及確定不同母本最適采樣時間，提高無核玫瑰香味葡萄胚挽救效率。利用分子標記技術(shù)對雜種F1代的無核性狀進行早期輔助選擇，以提高雜種后代無核選育效率。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

試驗于2019年5月—2020年6月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所（吐魯番市鄯善縣，北緯42.91°，東經(jīng)90.30°）、西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃及旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室完成。

用于萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因?qū)崟r定量PCR的葡萄品種有：濃香型品種‘莎巴珍珠’‘陽光玫瑰’‘玫瑰香’‘183’，淡香型品種‘巨玫瑰’‘早玫瑰’‘意大利’及無香型品種‘無核白’等，均定植于西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃中。

用于胚挽救雜交的試材中，母本為9個種子敗育型無核葡萄品種：‘愛神玫瑰’‘昆香無核’‘京早晶’‘火焰無核’‘美麗無核’‘莫麗莎無核’‘紅寶石無核’‘Fresno Seedless’‘Australian Seedless’，父本為5個玫瑰香味品種‘玫瑰香’‘陽光玫瑰’‘巨玫瑰’‘183’‘貴妃玫瑰’。以上雜交試驗于新疆維葡萄瓜果研究所進行，供試葡萄品種均采用水平棚架栽培，株距1 m，行距5 m。胚挽救雜交組合配置見表1。

1.2 萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因表達分析

以‘莎巴珍珠’等8個葡萄品種為試材，根據(jù)不同品種成熟情況，2019年7月下旬至9月上旬采集各品種成熟果實。稱取采集的成熟果實300 g，剝?nèi)」?.5～1 g置于2.0 mL無酶離心管后標號并迅速放入液氮中速凍，后放入超低溫冰箱備用。全程在冰上操作，防止RNA降解，其中果皮剝離時盡可能不粘連果肉。使用RNAperp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根）提取RNA，參照cDNA第一鏈合成預混試劑盒（Cofitt）使用說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于超低溫冰箱備用。以cDNA為模板，根據(jù)萜類物質(zhì)合成通路中各階段關(guān)鍵酶基因序列，利用軟件Primer 6設計引物（表2）并進行實時定量PCR檢測。引物參照Martin[8]的方法，使用VvActin和VvGAPDH2個看家基因作為內(nèi)參。實時定量PCR進行3次生物學重復，其數(shù)據(jù)分析利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行單因素方差分析，顯著性分析用Duncan's檢驗（P＜0.05）。

表1 無核香味胚挽救雜交組合配置Table1 Configuration of hybrid combinations

表2 試驗所需引物序列Table 2 Primers used in the experiment

1.3 胚挽救流程

采集并研磨花粉，密封保存并放于4 ℃冰箱備用。選擇長勢強壯的葡萄植株，采集粗壯結(jié)果母枝上發(fā)育良好的花序，用指尖輕輕掐去花冠頂蓋部，使花藥脫落，露出柱頭，避免傷害柱頭。去雄完成后，清理花穗上殘余花粉并套袋標記。去雄2～3 d 后，開始授粉，且有黏液時授粉最好。授粉時間以晴天上午8:00—10:00最佳，授粉結(jié)束應立即套袋。連續(xù)授粉3～4 d。不同雜交組合以最后一次授粉時間為準，在最適采樣期將整穗果實采回實驗室。從果柄處將果粒分別剪下，裝入網(wǎng)兜內(nèi)置于流水下沖洗3～4 h。在無菌條件下，將消毒干凈的果粒在玻璃培養(yǎng)皿中剝?nèi)∨咧椋瑢冸x的胚珠接種在MM3固體胚發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)。暗培養(yǎng)8～10周后，無菌條件下利用解剖鏡剝?nèi)‰s種胚，將胚平鋪在WPM胚萌發(fā)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，溫度為25±2 ℃。1個月后統(tǒng)計胚萌發(fā)數(shù)，2個月后統(tǒng)計成苗數(shù)，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，胚挽救具體程序參照本課題組前期研究方法[18,27-28]。胚發(fā)育率（%）＝發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)×100，成苗率（%）＝成苗數(shù)/接種胚數(shù)×100。

1.4 不同母本最佳采樣時間的確定

對‘京早晶’和‘Fresno Seedless’為母本的無核香味胚挽救雜交組合進行連續(xù)取樣，采樣時間為授粉后36～44 d，取樣間隔一天。將采下的果穗做好取樣時間及組合名稱標記并放在冰盒中保存，帶到實驗室于4 ℃冰箱備用。按照胚挽救流程統(tǒng)計數(shù)據(jù)并計算不同取樣時間下各組合的胚發(fā)育率和成苗率。

1.5 胚萌發(fā)培養(yǎng)基最適蕓苔素內(nèi)酯濃度篩選

試驗共設置了26種不同的胚萌發(fā)培養(yǎng)基，以WPM為基礎培養(yǎng)基（WPM 2.41 g/L＋蔗糖20 g/L＋瓊脂7 g/L＋活性炭1.5 g/L），分別添加不同濃度梯度的蕓苔素內(nèi)酯（brassinolide, BR）作胚萌發(fā)培養(yǎng)基并進行優(yōu)化。比較不同培養(yǎng)基中胚的萌發(fā)率，篩選最適胚萌發(fā)的BR添加濃度，統(tǒng)計胚萌發(fā)率。

1.6 分子標記輔助選擇無核葡萄胚挽救雜交子代

雜交親本及子代基因組DNA的提取，無核探針GSLP1-569及無核標記SCF27-2000的引物序列及反應程序參考李志瑛[24]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實中單萜類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達水平

對8個葡萄品種成熟果實中萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因進行實時熒光定量PCR檢測（圖1），其中7個為玫瑰香味品種，1個無香味品種作為對照。定量結(jié)果顯示，調(diào)控萜類物質(zhì)合成途徑前期的關(guān)鍵酶基因DXS1、DXS3、DXR及HDR均在濃香型品種中表達量最高。其中，DXS1及DXS3在‘陽光玫瑰’中表達量最高，DXS1在‘陽光玫瑰’中的表達量是其它品種的3～5倍；DXS3除在‘陽光玫瑰’中高表達外，在‘玫瑰香’中也有較高表達；DXR在‘183’中表達量最高，而在淡香型‘意大利’中和無香型‘無核白’中表達量較低；HDR在‘莎巴珍珠’及‘玫瑰香’成熟果實中表達量都較高。調(diào)控萜類物質(zhì)合成途徑中期的關(guān)鍵酶基因GPPS及FPPS在不同品種中表達呈現(xiàn)差異，GPPS在‘183’‘玫瑰香’‘陽光玫瑰’等濃香型品種中都有較高表達，而在‘意大利’中的表達量最低；FPPS在‘陽光玫瑰’及‘早玫瑰’中表達量最高，在‘陽光玫瑰’的表達量是其它品種的1～2.5倍，但其在部分濃香品種如‘玫瑰香’與‘莎巴珍珠’果實中的表達量并不高。調(diào)控萜類物質(zhì)合成途徑晚期的關(guān)鍵酶基因Linnalool syn和α-Terpineol syn在不同品種間的表達差異較大，Linnalool syn在‘陽光玫瑰’中的表達量最高，在‘早玫瑰’中的表達量次之；α-Terpineol syn在‘183’中的表達量顯著高于其它品種。α-Terpineol syn相較于其它酶基因在各成熟葡萄果實中的表達量也是最高的，是其它酶基因表達量的10～65倍。

2.2 親本基因型對無核香味葡萄胚挽救的影響

2.2.1 不同母本基因型對胚挽救的影響

試驗設置11個無核香味胚挽救雜交組合，共獲得雜種胚珠9731個，雜種苗511株。胚發(fā)育率在3.39%～55.63%，成苗率在6.88%～38.82%。

以‘陽光玫瑰’作父本與以‘紅寶石無核’及‘莫麗莎無核’作母本的雜種胚成苗率均高于以‘美麗無核’作母本的雜種胚，其成苗率分別達到38.82% 和18.92%。此外，在以‘玫瑰香’作父本配置的香味無核雜交組合中，‘Fresno Seedless’及‘Australian Seedless’作母本的組合成苗率高于以‘昆香無核’‘京早晶’及‘火焰無核’為母本的雜交組合，二者成苗率最高，分別為22.03%和27.60%。父本相同時，以‘紅寶石無核’作母本的雜種胚成苗率最高，可達到38.82%（表3）。

2.2.2 不同父本基因型對胚挽救的影響

以‘愛神玫瑰’作為母本與不同香味父本的組合中，‘183’作父本的組合成苗率略高于以‘巨玫瑰’作父本的組合，成苗率為17.07%。以‘昆香無核’作母本與不同香味父本雜交，‘玫瑰香’作父本的組合成苗率（18.75%）明顯高于以‘貴妃玫瑰’作父本的雜交組合。母本相同時，以‘玫瑰香’作父本的雜種胚成苗率最高，可達到18.75%（表3）。

2.3 取樣時間對無核香味葡萄胚挽救的影響

圖1 成熟果實中萜類物質(zhì)合成酶相關(guān)基因表達Figure 1 Expression of monoterpene synthase related genes in mature berries

胚挽救雜交組合‘京早晶×玫瑰香’在授粉后第42天胚發(fā)育率最高，達到13.33%；授粉后的36 d，成苗率最高，為18.18%；而在授粉后第38天，胚發(fā)育率為0。在不同取樣時間成活的雜交苗長勢均健康，根系發(fā)達。以‘Fresno Seedless’作為母本的雜交組合‘Fresno Seedless×玫瑰香’在授粉后的36 d胚發(fā)育率達到最高，為31.25%；同一時期的成苗率也最高，為33.33%；授粉后的40 d胚發(fā)育率最低，為13.68%（表4）。

2.4 不同濃度BR對無核香味葡萄胚挽救的影響

以‘紅寶石無核×陽光玫瑰’的雜種胚為材料，通過添加不同濃度的BR和6-BA對雜種胚萌發(fā)率的影響（表5）。與CK1相比，T2、T3處理對胚萌發(fā)有促進作用，分別高15.71%、21.59%，以T3處理效果最顯著，即生長調(diào)節(jié)劑的最適濃度為：0.1 mg/L BR＋0.2 mg/L 6-BA。隨著BR濃度升高，胚發(fā)育率有下降趨勢。當將6-BA替換為IAA，對比不同濃度梯度的BR和IAA對胚挽救育種的影響時，T7處理組對雜種胚萌發(fā)率的促進作用最明顯，比CK2高出14.30個百分點，即生長調(diào)節(jié)劑的最適濃度為BR 0.05 mg/L。而在改變BR與IAA的濃度進行不同處理時，其對應胚萌發(fā)率均低于對照組，沒有起到促進作用（表5）。T3與T7處理下長成的幼苗長勢均健壯，沒有出現(xiàn)畸形苗現(xiàn)象。

2.5 利用分子標記鑒定胚挽救雜交子代的無核性狀

2.5.1 無核探針GSLP1-569檢測胚挽救親本及雜交子代的無核性狀

表3 無核香味葡萄胚挽救發(fā)育成苗情況Table 3 The result of embryo rescue for breeding seedlessness with aroma grapevine

表4 采樣時間對無核香味葡萄胚挽救育種結(jié)果的影響Table 4 The effect of sampling time on embryo rescue for innovation of seedlessness and flavor grapevine

表5 不同濃度BR對胚挽救育種的影響Table 5 Effects of BR at different concentrations on embryo rescue breeding

利用無核探針GSLP1-569對雜交組合中14個雙親進行無核性狀篩選。其中可擴增出569 bp條帶的母本品種有：‘火焰無核’‘美麗無核’‘Fresno Seedless’和‘Australian Seedless’4個品種；未出現(xiàn)特異性條帶的父本品種有：‘巨玫瑰’‘玫瑰香’‘貴妃玫瑰’和‘183’4個品種（圖2A）。即無核探針GSLP1-569可用于檢測‘火焰無核×玫瑰香’‘Fresno Seedless×玫瑰香’及‘Australian Seedless×玫瑰香’雜交后代無核性狀。

使用無核探針GSLP1-569對‘火焰無核×玫瑰香’的8個雜交子代的檢測結(jié)果中，擴增出569 bp特異性條帶的共5個株系（圖2B）；對‘Fresno Seedless×玫瑰香’的8個雜交子代的檢測結(jié)果中，其8個子代中全部擴增出569 bp特異性條帶（圖2C）；對‘Australian Seedless×玫瑰香’的8個雜交子代的檢測結(jié)果中，全部擴增出569 bp特異性條帶（圖2D）。

2.5.2 無核標記SCF27-2000檢測胚挽救親本及雜交子代的無核性狀

利用無核標記SCF27-2000對雜交組合中14個雙親進行無核性狀篩選，可擴增出2000 bp條帶的母本品種有：‘美麗無核’‘紅寶石無核’和‘Fresno Seedless’3個品種；‘巨玫瑰’‘183’‘貴妃玫瑰’‘陽光玫瑰’和‘玫瑰香’5個父本品種均未擴增出2000 bp的特異性條帶（圖3A），即無核探針SCF27-2000可用于檢測‘美麗無核×陽光玫瑰’‘Fresno Seedless×玫瑰香’及‘紅寶石無核×陽光玫瑰’雜交后代無核性狀。

使用無核分子標記SCF27-2000對‘美麗無核×陽光玫瑰’7個雜交子代的檢測結(jié)果中，擴增出2000 bp特異性條帶的共5個株系（圖3B）；對‘Fresno Seedless×玫瑰香’8個雜交子代的檢測結(jié)果中，擴增出2000 bp特異性條帶的共6個株系（圖3C）；對‘紅寶石無核×陽光玫瑰’子代的檢測結(jié)果中，其17個子代中11個株系擴增出2000 bp特異性條帶（圖3D）。

3 討論與結(jié)論

無核香味葡萄的育種已經(jīng)開展了很多年，但少有新品種被推出，其主要原因是對香味形成機理的研究較少。目前，已知的成果是萜烯類物質(zhì)是玫瑰香味的主要呈香物質(zhì)。前期賈姍姍已經(jīng)對葡萄品種的果實香味物質(zhì)含量進行了測定，篩選出‘亞歷山大’‘陽光玫瑰’‘玫瑰香’等玫瑰香味物質(zhì)含量相對較高的品種[19]。在此基礎上，分別對不同香型的葡萄品種中控制萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因進行表達分析，8個酶基因在不同香型葡萄品種中的表達具有差異，總體呈現(xiàn)為在濃香型品種中表達量高于淡香型品種，無香品種基因表達量最低，其中以‘陽光玫瑰’‘玫瑰香’‘183’等品種較為突出。在后期胚挽救雜交組合配置中可優(yōu)先選擇這些品種作為香味父本，而各萜類物質(zhì)關(guān)鍵酶基因在‘意大利’中的表達均不高，不建議選擇其作為親本。值得注意的是，MEP代謝通路晚期的酶基因Linnalool syn和α-Terpineol syn的表達量顯著高于代謝途徑前、中期的酶基因。Linnalool syn和α-Terpineol syn分別在萜類合成通路中調(diào)控里那醇和萜品醇的合成，果實在成熟期香味最為濃郁，果實內(nèi)積累大量萜類物質(zhì)，故而相關(guān)酶基因的表達量顯著高于通路前、中期的相關(guān)酶基因，可由此作為開發(fā)香味基因分子標記的參考依據(jù)，對胚挽救獲得的雜種后代進行香味基因分子標記輔助選擇，提高優(yōu)質(zhì)品種的選育效率。

圖2 無核探針GSLP1-569對親本及雜交子代的檢測Figure 2 The detection of grape parents and hybrid progeny with seedlessness gene using GSLP1-569 probe

圖3 無核分子標記SCF27-2000對親本及雜交子代的檢測Figure 3 The detection of grape parents and hybrid progeny with seedlessness gene using the molecular marker of SCF27-2000

通過胚挽救育種技術(shù)成功實現(xiàn)將香味和無核性狀的疊加，創(chuàng)制無核玫瑰香味新種質(zhì)。當親本基因型不同時，胚挽救雜交組合的成苗率差異較大。研究中‘紅寶石無核×陽光玫瑰’雜交組合的胚萌發(fā)率和成苗率都最高，與前人研究得到‘紅寶石無核’適宜用來配置胚挽救組合結(jié)果一致[19]。其原因可能是‘紅寶石無核’與其他葡萄親本的親和性強，有利于受精胚的發(fā)育和生長。此外，‘Fresno Seedless’作為母本時成苗率也較高，且以其作為母本的雜交幼苗長勢較其他組合更為健壯，具有生根快的特點，在胚挽救組合的配置中也可作為優(yōu)良母本供選。不宜選擇‘昆香無核’‘美麗無核’‘京早晶’等品種配置胚挽救雜交組合，以上品種作母本的雜交組合成苗率都較低，有可能是由于胚敗育發(fā)生過早導致胚珠活力低，挽救效果較差?；谇捌谳祁愇镔|(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的表達分析，篩選香味基因表達較高的品種配置雜交組合，篩選出的材料有：‘陽光玫瑰’‘玫瑰香’‘183’。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，還增選‘貴妃玫瑰’‘巨玫瑰’作為胚挽救雜交組合香味父本。在母本相同的情況下，以‘玫瑰香’‘183’作為父本配置的雜交組合成苗率較其他組合更高，因此適合將其作為父本選育香味種質(zhì)，父本的基因型對胚挽救育種效率也具有影響。

在胚挽救育種技術(shù)中，果實的取樣時間是重要的影響因素[20]，其主要原因是取樣時間不同導致雜種胚的發(fā)育程度不同[21-22]。研究中的供試母本‘京早晶’是優(yōu)質(zhì)早熟無核葡萄品種，在北京地區(qū)5月下旬開花，7月下旬果實成熟[23]。研究配置的‘京早晶×玫瑰香’雜交組合是在位于新疆的鄯善進行，在授粉后的36 d和42 d取樣都具有較高的胚發(fā)育率，42 d時取樣胚發(fā)育率最高，達到13.33%?？赡苡捎诖藭r胚的發(fā)育程度較高，也可能與新疆當?shù)貧夂蛴嘘P(guān)，授粉后42 d時已為6月末，鄯善當?shù)氐娜站鶜鉁貫?2～37 ℃，日照時間充足，降水量少，氣候干燥，利于雜種胚在果實內(nèi)生長發(fā)育，因此在葡萄生長環(huán)境與新疆當?shù)貧夂蛳嘟鼤r，建議在授粉后42 d采樣為宜。本研究的另一供試母本‘Fresno Seedless’是種子敗育型無核葡萄品種，李志瑛[24]研究得出‘Fresno Seedless’葡萄的胚挽救最佳取樣時期是花后32～36 d。研究配置的‘Fresno Seedless×玫瑰香’雜交組合是在陜西楊凌進行授粉作業(yè)，在授粉后36 d雜種胚的發(fā)育率和成苗率都最高，這與前人研究結(jié)果一致[24]，建議將授粉后36 d作為‘Fresno Seedless’最佳采樣時間。

胚萌發(fā)培養(yǎng)基中的激素成分對雜種胚的存活與發(fā)育有重要影響[25]。BR是一種廣譜高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以促進細胞伸長和分裂，在葡萄上也有應用研究[26]。在試驗中，選取不同濃度梯度的BR分別與6-BA、IAA組合添加至胚萌發(fā)WPM基礎培養(yǎng)基中，在同時添加適宜濃度的BR和6-BA時，‘紅寶石無核×陽光玫瑰’雜交組合的后代胚萌發(fā)率顯著高于對照組，推測BR與6-BA在適宜濃度范圍內(nèi)對雜種胚的萌發(fā)具有協(xié)同作用，以0.1 mg/L BR＋0.2 mg/L 6-BA處理效果最好。而在同時添加不同濃度梯度的BR和IAA兩種激素時，胚萌發(fā)率均低于對照組，可能是由于IAA與BR均為生長素，作用機理相近，重復添加致使胚萌發(fā)培養(yǎng)基中生長素濃度過高從而抑制幼胚的生長。在添加了BR的胚挽救雜種胚萌發(fā)成苗后，根系均較未添加BR的幼苗健壯發(fā)達，長勢良好，未出現(xiàn)畸形苗，推測BR還具有促根生長的作用，可在繼代培養(yǎng)基中可以添加使用。

研究利用GSLP1-569及SCF27-2000兩種無核分子標記對雜交組合的親本及子代進行檢測，在56個雜種子代中進行無核基因分子標記檢測，篩選出14個同時攜帶兩種不同無核分子標記的特異條帶。檢測結(jié)果表明，‘Fresno Seedless×玫瑰香’雜交組合后代進行無核基因分子標記檢測時，其F1代無核率達到87.5%，說明‘Fresno Seedless’作母本時雜交后代無核率高，可將其作為配置胚挽救雜交組合的優(yōu)勢親本。

綜上，通過研究萜類物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶基因表達分析篩選出適合無核香味胚挽救育種的父本品種有‘玫瑰香’‘183’‘陽光玫瑰’。利用胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無核香味葡萄新種質(zhì)，以‘紅寶石無核’‘Fresno Seedless’作母本和以‘玫瑰香’‘183’作父本的雜交組合胚挽救成苗率較高?！┰缇А啊瓼resno Seedless’為母本的雜交組合最佳采樣時間分別為授粉后42 d和36 d。WPM培養(yǎng)基＋0.1 mg/L BR＋0.2 mg/L 6-BA可以促進胚挽救的幼胚生根。在56個雜種后代中進行無核基因標記檢測，篩選出14個雜種后代同時攜帶不同無核分子標記的特異條帶。今后還要對這些雜種植株的無核性狀和香味進行田間調(diào)查，為無核香味葡萄育種提供新種質(zhì)。