呂政頤， 孫根行， 安 丹， 謝林花

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

氫氣作為一種清潔能源，被認(rèn)為是緩解能源短缺和環(huán)境污染問(wèn)題的理想燃料[1,2].目前，大部分氫氣是由煤、石油、天然氣等不可再生資源催化重整或水電解產(chǎn)生的，這些傳統(tǒng)方法耗能大且對(duì)環(huán)境不友好.與其他制氫方法相比，利用可再生資源進(jìn)行發(fā)酵制氫具有環(huán)境友好、在溫和條件下能耗低等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有前途的制氫方法[3].

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)因其豐富、廉價(jià)、可再生的特點(diǎn)，被用于氫氣的生產(chǎn)，以實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)發(fā)展.在生產(chǎn)過(guò)程中，首先將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)通過(guò)機(jī)械法、物理法、化學(xué)法、生物法以及這些方法的綜合運(yùn)用[4-8]轉(zhuǎn)化為單糖，再通過(guò)發(fā)酵生成H2.

纖維素生物質(zhì)生物降解的主要困難是由于其高度有序的晶體結(jié)構(gòu)被分子間氫鍵所穩(wěn)定.過(guò)去幾十年來(lái)，人們對(duì)不同木質(zhì)纖維素生物質(zhì)和預(yù)處理的水解進(jìn)行了廣泛研究.在所有預(yù)處理方法中，稀酸預(yù)處理被認(rèn)為是制氫最有效的方法.玉米秸稈稀酸預(yù)處理工藝參數(shù)對(duì)制氫的影響研究較少.利用響應(yīng)面法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以有效地篩選關(guān)鍵因素，優(yōu)化水解工藝參數(shù)[9-13].

因此，為優(yōu)化玉米秸稈稀酸水解預(yù)處理水解參數(shù)，采用標(biāo)準(zhǔn)RSM設(shè)計(jì)，以水解物為碳源，進(jìn)行暗發(fā)酵制氫試驗(yàn).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 產(chǎn)氫細(xì)菌的篩選

該微生物從西安市郊區(qū)采集的奶牛糞便中分離得來(lái).產(chǎn)氫菌株的富集、分離和培養(yǎng)所使用的基本培養(yǎng)基及菌株分離的方法[14]在前人的研究中已經(jīng)提到.本研究分離出多個(gè)梭菌菌株，得到產(chǎn)氫量最高的菌株YA001.

1.2 材料

玉米秸稈從西安郊區(qū)收集，并研磨成60目左右的大小.收集固體顆粒，在80 ℃下干燥12小時(shí)后裝入密封塑料袋，在4 ℃下保存.其性狀如下：總固體含量(TS)96.51%，總揮發(fā)性固體含量(TVS)84.61%，灰分含量11.9%.

1.3 玉米秸稈水解

通過(guò)改變水解溫度、反應(yīng)時(shí)間、水解次數(shù)、鹽酸濃度和固液比等參數(shù)優(yōu)化水解參數(shù).水解過(guò)程中，將水解液用布氏漏斗過(guò)濾，然后用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)?，直至洗滌水變成pH 7.0，再用固體殘?jiān)M(jìn)行下一步稀酸水解.樣品取自每一步的水解產(chǎn)物.收集所有水解產(chǎn)物進(jìn)行分析和氫氣發(fā)酵.

1.4 發(fā)酵制氫

所有實(shí)驗(yàn)均在330 mL反應(yīng)器中進(jìn)行.在反應(yīng)器中，混合液250 mL包括接種量(5%)、2.5 g玉米秸稈的總水解物、10 mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液(終濃度50 mM，pH值6.8)和20 mL營(yíng)養(yǎng)液.將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)整為6.8.反應(yīng)器最初用氮?dú)鉀_洗以去除氧氣，蓋上橡膠塞子在中溫(37±1℃)條件下，將反應(yīng)器放置在轉(zhuǎn)速為150 r/min的軌道搖床中.所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3次，取平均數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.5 分析方法

采用氣相色譜儀(SP-3400)進(jìn)行氫氣濃度的測(cè)定.測(cè)試條件：后檢測(cè)器溫度：250 ℃；柱箱溫度：90 ℃；載氣：Ar.

氫氣體積依據(jù)公式(1)計(jì)算[14]：

V=Vori+∑Viri

(1)

式(1)中：V-累計(jì)產(chǎn)氫量；Vo-反應(yīng)器上部空間；Vi-反應(yīng)器實(shí)時(shí)排出的液體體積；ri-實(shí)時(shí)氫氣濃度.

采用3，5-二硝基水楊酸比色法(DNS)[15]測(cè)定可溶性糖的含量；采用重量分析法分別在105 ℃干燥箱和600 ℃馬弗爐中測(cè)定TS和TVS的含量；玉米秸稈樣品的結(jié)晶度指數(shù)(CrI)通過(guò)衍射儀 (PANalytical:X′pert PRD)在40 kV和40 mA銅輻射下測(cè)定；根據(jù)segal經(jīng)驗(yàn)方法[16]計(jì)算CrI.用掃描電子顯微鏡(SEM)拍攝玉米秸稈的顯微照片.

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

第一步優(yōu)化的目的是在一階多項(xiàng)式模型的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選對(duì)制氫有顯著影響的因素，這是一種篩選重要變量的有效技術(shù)[17].

Y=β0+∑βixi

(2)

式(2)中：Y為反應(yīng)量即氫氣產(chǎn)量(mL H2/g-TVS)；β0、βi和xi分別為模型截距、線性系數(shù)和自變量水平.

對(duì)酸濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度、水解次數(shù)和固液比等5個(gè)因素進(jìn)行了研究.基于Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對(duì)每個(gè)因子進(jìn)行兩個(gè)水平測(cè)試：低水平為-1，高水平為+1.表1顯示了各因素的水平和顯著性，表2列出了設(shè)計(jì)矩陣.通過(guò)12個(gè)實(shí)驗(yàn)考察5個(gè)因素.三次產(chǎn)氫量取平均值作為響應(yīng).選取95%水平(P<0.05)的因素作為產(chǎn)氫的重要因素并進(jìn)行進(jìn)一步研究.為了獲得最優(yōu)區(qū)域，沿路徑進(jìn)行了最速上升實(shí)驗(yàn)，如表3所示.

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的變量水平與統(tǒng)計(jì)分析

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及最速上升結(jié)果

1.6.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)

在Box-Behnken設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，采用RSM對(duì)篩選的制氫變量進(jìn)行優(yōu)化.在統(tǒng)計(jì)計(jì)算中，編碼值與實(shí)際值的關(guān)系描述為：

(3)

變量的水平和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4所示.在本實(shí)驗(yàn)中共進(jìn)行了15次試驗(yàn)，反應(yīng)值為三次試驗(yàn)的平均值.

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行回歸分析.二次多項(xiàng)式方程擬合變量與響應(yīng)之間的關(guān)系，以預(yù)測(cè)最佳條件，二階多項(xiàng)式模型如式(4)所示：

(4)

式(4)中：Yi為預(yù)測(cè)響應(yīng);β0為常數(shù);βi為襯墊系數(shù);βii為平方系數(shù)，βij為交乘系數(shù)，xi、xj為獨(dú)立變量.

分別使用軟件Minitab 16.0版和origin 9.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的回歸和圖形分析.通過(guò)求解回歸方程，同時(shí)分析響應(yīng)面等值線圖，得到所選變量的最優(yōu)值[18].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離和鑒定

將去離子水浸泡過(guò)的奶牛糞便的細(xì)菌濾液富集在基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中.在瓊脂平板上培養(yǎng)后，選擇44個(gè)菌株進(jìn)行產(chǎn)氫試驗(yàn).其中，菌株YA001的產(chǎn)氫性能最高，菌株YA001呈橢圓形，末端為圓形，寬度為1.0μm，長(zhǎng)度為2.0～2.5μm[19].它們是雙分裂、革蘭氏陰性、孢子菌.該菌株可在厭氧條件下生長(zhǎng).

利用Blast程序?qū)A001菌株的16S rRNA序列(1471bp)與NCBI網(wǎng)站的公共基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì).菌株YA001的16S rRNA序列與ClostridiumbeijerinckiiNCIMB 8052有99%的同一性，因此將YA001菌株鑒定為Clostridiumbeijerinckii[19].

2.2 利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)影響產(chǎn)氫的因素

采用placketer-burman設(shè)計(jì)方法研究了酸濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、水解次數(shù)和固液比在制氫中的相對(duì)重要性.Plackett-Burman設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析中的參數(shù)值列于表1.X1(酸濃度)、X2(溫度)和X3(水解次數(shù))對(duì)產(chǎn)氫量有顯著性，將被納入進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn).其他變量對(duì)產(chǎn)氫的顯著性較低，所以在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中均以低水平(-1)使用.

2.3 最速的上升路徑

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了最陡上升，增加X(jué)1(酸濃度)、X2(溫度)和X3(水解次數(shù))，以提高反應(yīng)速度，接近最值區(qū)域.在酸濃度0.6%，反應(yīng)溫度130 ℃，水解次數(shù)3的條件下，達(dá)到了最佳區(qū)域，最高響應(yīng)為146.09 mL H2/g-TVS，表明該步已接近優(yōu)化區(qū)域，選擇進(jìn)一步優(yōu)化以獲得最高響應(yīng).

2.4 優(yōu)化稀酸水解制氫的關(guān)鍵因素

2.4.1 回歸分析及方差分析

通過(guò)RSM的Box-Behnken設(shè)計(jì)，研究了關(guān)鍵因素(酸濃度、溫度和水解次數(shù))的最佳水平及其相互作用對(duì)產(chǎn)氫的影響.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、各變量的實(shí)際水平及所進(jìn)行的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示.

表4 三個(gè)獨(dú)立變量的Box-Behnken設(shè)計(jì)

產(chǎn)氫量的Box-Behnken設(shè)計(jì)的回歸分析和方差分析分別如表5和表6所示.

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

表6 回歸模型方差分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到二階多項(xiàng)式方程數(shù)學(xué)模型，如式(5)所示：

(5)

式(5)中：Y為預(yù)測(cè)產(chǎn)氫量(mL H2/g-TVS)；X1、X2和X3分別為酸濃度、溫度和水解次數(shù)的編碼值.

采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)二次方程模型擬合的充分性和顯著性，方差分析的總結(jié)如表6所示.這里的R2值，即測(cè)定系數(shù)，是衡量模型擬合度好壞的指標(biāo)，接近1.0表明二次方程模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表現(xiàn)出非常好的擬合度.在該模型中，R2為98.46%、95.68%，這表明該模型在本研究中對(duì)氫氣生產(chǎn)非?？煽?

2.4.2 關(guān)鍵因素對(duì)產(chǎn)氫量的影響

(1)酸濃度對(duì)產(chǎn)氫量的影響

酸濃度是酸水解過(guò)程中糖類釋放和降解的關(guān)鍵參數(shù)，對(duì)產(chǎn)氫量也起著重要作用，如圖1(a)～(d)所示，在溫度或水解次數(shù)不變的情況下，隨著酸濃度的逐漸升高產(chǎn)氫量越高.產(chǎn)氫量隨酸濃度的增加而升高，是因?yàn)樗釢舛鹊脑黾邮箽潆x子數(shù)量增加，邊界層電荷擾動(dòng)增加，促進(jìn)了還原糖的釋放[21].

產(chǎn)氫量隨酸濃度的增加而升高，是因?yàn)樵谝种茲舛认?，產(chǎn)氫量與還原糖含量的增加呈正相關(guān).產(chǎn)氫量隨酸濃度的進(jìn)一步增加而降低，超過(guò)其最佳點(diǎn)，如圖1(a)～(d)所示，這是由于在含高濃度酸的預(yù)處理?xiàng)l件下，還原糖降解為糠醛、5-HMF或其他副產(chǎn)物所致[22].

(a)溫度和酸濃度對(duì)產(chǎn)氫量影響的響應(yīng)面圖

(b)溫度和酸濃度的等高線圖

(c)水解次數(shù)和酸濃度對(duì)產(chǎn)氫量影響的響應(yīng)面圖

(d)水解次數(shù)和酸濃度的等高線圖

(f)水解次數(shù)和溫度的等高線圖圖1 產(chǎn)氫量的響應(yīng)面圖和相應(yīng)的等高線圖

(2)水解次數(shù)對(duì)產(chǎn)氫量的影響

水解次數(shù)對(duì)糖的釋放有很大的影響，從而對(duì)產(chǎn)氫量產(chǎn)生較大影響.如圖1(e)、(f)所示，隨著水解次數(shù)的增加，產(chǎn)氫量迅速增加.在水解次數(shù)為3次時(shí)，產(chǎn)氫量達(dá)到最大值，之后隨著水解次數(shù)的進(jìn)一步增加，產(chǎn)氫量降低.由表7所示，隨著水解次數(shù)的增加，還原糖產(chǎn)率和水解率迅速下降，而且隨著水解次數(shù)的增加，糠醛、5-HMF和乙酸不斷積累[23]，導(dǎo)致產(chǎn)氫率下降.當(dāng)水解次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，還原糖的產(chǎn)量不會(huì)大幅度提高，而且積累了更多對(duì)制氫有害的副產(chǎn)物.因此水解次數(shù)不應(yīng)超過(guò)3次.

(3)溫度對(duì)產(chǎn)氫量的影響

溫度是影響產(chǎn)氫量的重要因素，如圖1(a)、(b)、(e)、(f)所示，在達(dá)到最高點(diǎn)之前，在酸水解濃度的條件下，產(chǎn)氫量會(huì)隨著溫度的升高而變高，這是由于玉米秸稈的結(jié)構(gòu)受到溫度的破壞.在常溫下，多糖以穩(wěn)定的結(jié)晶形式(環(huán)狀)存在.在較高溫度下，多糖中的大部分單糖以開(kāi)鏈形式存在.隨著溫度的升高，分子獲得了更高的動(dòng)能，氫離子與玉米秸稈之間的碰撞速率加大，氫離子隨機(jī)攻擊糖苷鍵，超過(guò)了活化能屏障，導(dǎo)致水解降解反應(yīng)的發(fā)生[21].隨著溫度的進(jìn)一步升高，產(chǎn)氫量逐漸下降.對(duì)于該現(xiàn)象，Bustos等[24]和Lee等[25]認(rèn)為，酸用于水解，需要相對(duì)較高的預(yù)處理溫度，在較高的預(yù)處理溫度下產(chǎn)生糠醛、5-HMF等有機(jī)酸抑制性產(chǎn)物，抑制了后期氫氣的產(chǎn)生.

2.4.3 各因素之間的相互作用對(duì)產(chǎn)氫量的影響

圖 1(b)、(d)、(f) 所示的橢圓等高線圖表明變量間的相互作用是顯著的.相反，圖1(f)所示為圓形等高線圖，這表明溫度和水解次數(shù)之間的相互作用是輕微的相互依賴，它們的相互作用對(duì)制氫的影響可以忽略不計(jì).如圖1(a)、(b)所示，溫度的變化對(duì)產(chǎn)氫量的影響比酸濃度的變化大.如圖1(c)、(d)所示，水解次數(shù)的變化對(duì)產(chǎn)氫量的影響比較顯著，而酸濃度的變化不重要.此外，如圖1(e)、(f)所示，與溫度的變化相比，水解次數(shù)的變化不太顯著.總體來(lái)說(shuō)，三個(gè)變量對(duì)產(chǎn)氫量的重要性為：溫度>水解次數(shù)>酸濃度.本研究表明，溫度對(duì)稀酸水解玉米秸稈水解液產(chǎn)氫起著重要作用.

2.5 模型的驗(yàn)證

根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化后的玉米秸稈稀酸水解參數(shù)為：鹽酸濃度0.61%，溫度129.85 ℃，水解次數(shù)3次，反應(yīng)時(shí)間30 min，固液比1∶10.在上述優(yōu)化條件下，得到產(chǎn)氫量為149.52 mL H2/g-TVS，遠(yuǎn)高于未進(jìn)行預(yù)處理時(shí)的0.78 mL/g-TVS.

2.6 玉米秸稈的生物降解機(jī)制

2.6.1 玉米秸稈的X-射線衍射(XRD)分析

纖維素生物質(zhì)的結(jié)晶度經(jīng)常被作為評(píng)價(jià)生物質(zhì)水解和生物利用的一個(gè)因素.測(cè)定了原玉米秸稈(RC)、水解1～4次(ACO、ACT、ACS和ACF) 以及制氫后的玉米稈殘?jiān)鼧悠?ACH)等的X射線衍射圖譜，其結(jié)果如圖2所示.CrI由XRD測(cè)試數(shù)據(jù)確定和估算.ACO、ACT、ACS、ACF、ACH和RC的降解率(DR)、CrI和可溶性糖產(chǎn)率(SSY)如表7所示.

圖2 RC、ACO、ACS、ACT、ACF和ACH的X射線衍射圖譜

表7 ACO、ACT、ACS、ACF、ACH和RC的DR、CrI和SSY

由于去除了半纖維素，CrI、DR和SSY分別由35.55%、0%和0 mg/g tvs提高到50.91%、39.37%和416.67 mg/g tvs.ACO、ACT、ACS和ACF樣品的DR和SSY隨水解次數(shù)的增加而逐漸降低，得出水解次數(shù)不應(yīng)超過(guò)三次的結(jié)論.ACT的CrI從ACO的50.91%降至47.24%，表明可以降解纖維素，但纖維素的降解率很低.ACS和ACF的CrI、DR和SSY變化不大，說(shuō)明半纖維素完全降解，纖維素降解緩慢.

產(chǎn)氫后，ACH的DR和CrI分別下降到3.9%和48.2%，說(shuō)明產(chǎn)氫菌進(jìn)一步破壞了玉米秸稈的 結(jié)晶.但與ACF相比，ACH的DR和CrI變化不大，說(shuō)明稀酸水解對(duì)玉米秸稈產(chǎn)氫的影響較大.

2.6.2 玉米秸稈在降解過(guò)程中的形態(tài)變化分析

常用SEM來(lái)觀察和研究纖維素生物質(zhì)的表面特征和形態(tài)特征.圖3顯示了玉米秸稈水解過(guò)程中各步驟的形態(tài)變化和制氫后玉米稈的形態(tài).未被破壞的玉米稈表面光滑、連續(xù)(如圖3(a)所示).玉米稈表面越來(lái)越松散，逐漸被破壞，說(shuō)明隨著水解次數(shù)的增加，木質(zhì)素、纖維素被破壞，半纖維素溶解(如圖3(b)～(e)所示).稀酸水解樣品的固體秸稈樣品經(jīng)氫氣發(fā)酵降解成蜂窩狀微孔，表明產(chǎn)氫微生物對(duì)玉米秸稈殘?jiān)男螒B(tài)(如圖3(f)所示)破壞明顯.圖3片證明玉米秸稈的形態(tài)變化不僅來(lái)自于酸水解，也來(lái)自于微生物降解.

(a)RC (b)ACO

(c)ACT (d)ACS

(e)ACF (f)ACH圖3 玉米秸稈樣品的掃描電子顯微照片

2.7 生物制氫的產(chǎn)量

表8總結(jié)了一些文獻(xiàn)中關(guān)于纖維素原料水解用酸催化劑進(jìn)行生物制氫的研究.本研究中獲得最高產(chǎn)氫量為149.52 mL H2/g-TVS；257.04 mL H2/g R-sugar，與已有研究相比處于中上水平.

表8 利用纖維素水解物發(fā)酵制氫產(chǎn)量的比較

3 結(jié)論

響應(yīng)面設(shè)計(jì)是優(yōu)化玉米秸稈水解關(guān)鍵工藝參數(shù)的一種有效方法，可以最大限度地提高玉米秸稈的制氫效率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酸濃度為HCL 0.61%、溫度129.85 ℃、水解時(shí)間30 min、水解次數(shù)為3、固液比1∶10的條件下，還原糖產(chǎn)率為581.7 mg/g-TVS，最大產(chǎn)氫量為149.52 mL/g-TVS.

利用掃描電鏡對(duì)玉米秸稈水解制氫前后的微生物特性和表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步研究.結(jié)果表明，稀酸水解對(duì)玉米秸稈的制氫還原糖具有重要作用，玉米秸稈的降解不僅是水解反應(yīng)，而且是生物降解反應(yīng).