李霞飛，李自良，賈夢(mèng)夢(mèng)，陳云瑞，向 導(dǎo)，張旺鋒，張亞黎

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2.新疆烏蘭烏蘇農(nóng)業(yè)氣象試驗(yàn)站/烏蘭烏蘇國(guó)家綜合氣象觀測(cè)專項(xiàng)試驗(yàn)外場(chǎng)，新疆烏蘭烏蘇 832199)

0 引 言

【研究意義】花青素主要通過過濾、衰減和反射高強(qiáng)度的藍(lán)紫光從而調(diào)節(jié)對(duì)光能的吸收[1]，陳靜等[2]研究低溫弱光下光化學(xué)能力降低導(dǎo)致過量激發(fā)能的積累，而花青素的存在能夠維持一定的光合能力?；ㄇ嗨氐拇嬖谀軌驕p少PSII中的過剩激發(fā)能，有效保護(hù)PSII的光合活性[3-4]；薛占軍等[5]研究花青素通過吸收400～600 nm的可見光，有效保護(hù)PSI的活性。張開明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，含有花青素的紅葉光合速率較低，主要是由于花青素限制了葉綠體對(duì)光能的吸收，影響光反應(yīng)中心的開放從而影響碳同化過程，花青素與植物光合作用有密切聯(lián)系[7]。分析含有花青素的棉花光合參數(shù)的變化，對(duì)研究花青素作為光保護(hù)機(jī)制的研究有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物生育進(jìn)程中常出現(xiàn)各種逆境脅迫，將導(dǎo)致光合器官吸收的光能不能全部用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，過剩的光能會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，破壞植物光合機(jī)構(gòu)，影響光合作用的穩(wěn)定運(yùn)行[8]。為了防止光損傷的發(fā)生，植物激發(fā)了各種光保護(hù)機(jī)制來減少過剩激發(fā)能的積累，包括葉片運(yùn)動(dòng)[9]、以無害熱量形式散失的熱耗散[10]、通過光化學(xué)途徑產(chǎn)生能量物質(zhì)促進(jìn)D1蛋白的合成，修復(fù)光反應(yīng)中心[11-12]，以及圍繞PSI的環(huán)式電子傳遞[13-14]。花青素也可以作為一種光保護(hù)機(jī)制維持光合機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定運(yùn)行[15]。依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散[16-18]是保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷的重要的光保護(hù)機(jī)制，類黃酮類物質(zhì)在長(zhǎng)期的光保護(hù)過程中比葉黃素循環(huán)更為重要[19]，但也有研究表明花青素并不具有光保護(hù)作用[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】花青素可以作為一種光保護(hù)機(jī)制保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷。有關(guān)花青素和其他光保護(hù)機(jī)制環(huán)式電子流和葉黃素循環(huán)的熱耗散之間關(guān)系的研究較少。以不同花青素含量的棉花為材料，研究花青素含量的差異對(duì)其光合性能的影響以及為維持光合機(jī)構(gòu)運(yùn)行所啟動(dòng)的光保護(hù)機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析花青素含量差異與光保護(hù)機(jī)制的關(guān)系，為棉花的高光效育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2018年在新疆中國(guó)氣象站烏蘭烏蘇生態(tài)與農(nóng)業(yè)氣象站(44°17’N，86°03’E)進(jìn)行。供試材料由國(guó)家棉花種質(zhì)資源中期庫(kù)(National Medium-term Gene Bank of Cotton in China)和國(guó)家棉花種質(zhì)資源平臺(tái)(National cotton germplasm resources platform)提供。圖1，表1

圖1 供試材料

表1 供試材料編號(hào)及名稱

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小區(qū)面積4.5 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。4月22日布滴灌帶，鋪膜后人工點(diǎn)播，2 d后進(jìn)行少量灌溉，保證出苗。寬窄行種植，株距12 cm，密度為22×104株/hm2，其他管理措施同一般大田管理。

待棉花進(jìn)入盛花期，葉片顏色均勻一致，取主莖上倒數(shù)第1片完全展開葉，每個(gè)材料取3次重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 葉綠素

將取回的棉花葉片用打孔器(孔徑5 mm)打成小圓片4個(gè)，放入 5 mL離心管，用約4 mL 80%的丙酮溶液浸提，置于完全遮光處浸提，定時(shí)振蕩至圓片完全褪綠。取其上清液用分光光度計(jì)UV-2041 型分光光度計(jì)(日本島津)比色，葉綠素含量的計(jì)算公式參考Lichtenthaler[21]。

1.2.2.2 花青素

選顏色均勻的棉花葉片，在葉脈兩側(cè)用5 mm打孔器取15個(gè)葉圓片，用15 mL 1%鹽酸甲醇溶液提取，在黑暗環(huán)境中浸提24～48 h，25 mL容量瓶定容，1%鹽酸甲醇溶液為空白對(duì)照。在波長(zhǎng)530和652 nm處測(cè)其吸光度?；ㄇ嗨睾炕ㄇ嗨?Ant)=A550-0.25A652[22]。

1.2.2.3 光合參數(shù)

Li-6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(Li-COR，USA)測(cè)定光合氣體參數(shù)凈光合速率(Pn)。測(cè)定時(shí)，設(shè)置光強(qiáng) 2 000 μmol/(m2·s)、CO2濃度(400±2) μmol/(m2·s)、氣體流量300 μmol/s，葉片溫度(30±2)℃，參比室的水分(20±2) μmol/(m2·s)。將棉花葉片左上部加入葉室，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.4 吸光系數(shù)

用Imaging-PAM熒光成像儀(Walz，德國(guó))測(cè)定吸光系數(shù)。首先校準(zhǔn)儀器，然后將被測(cè)材料放置到成像區(qū)域，用樣品架上的細(xì)線固定材料，在材料中上部葉脈兩側(cè)選擇5～6個(gè)區(qū)域，測(cè)定吸光系數(shù)(Abs)。

1.2.2.5 NDH活性

利用Dual-PAM-100葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，德國(guó))測(cè)量NDH活性和P700暗還原速率。將取回的棉花材料放置在室溫條件下進(jìn)行0.5～1 h黑暗適應(yīng)，打開光化光AL(1 828 μmol/(m2·s))進(jìn)行熒光誘導(dǎo)，待熒光信號(hào)趨于平緩狀態(tài)(大概4 min左右)，關(guān)掉光化光熒光信號(hào)先下降后立即上升，熒光信號(hào)立即上升速率能夠反映NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性[23]。

1.2.2.6 P515吸收變化

單周轉(zhuǎn)飽和閃光誘導(dǎo)活體棉花葉片的P515快速馳豫動(dòng)力學(xué)可以反映類囊體膜的完整性和ATP合成酶活性[24]。經(jīng)過1 h暗適應(yīng)后，P515吸收信號(hào)先快速上升，緩慢上升，達(dá)到峰值后，緩慢下降。先打開光化光(1 800 μmol/(m2·s))照光10 min，后暗適應(yīng)4 min，P515吸收信號(hào)先快速上升后快速下降，緩慢上升相消失。暗適應(yīng)后P515吸收信號(hào)緩慢下降，膜的完整性，照光后P515吸收信號(hào)快速下降的初始斜率可以用來表示ATP酶活性[25]。

利用Dual-PAM-100(Walz，Germany)的新模塊P515/535 檢測(cè)雙波長(zhǎng)550～515差示吸收的信號(hào)變化。將供試材料充分暗適應(yīng)(至少1 h)，測(cè)定的515信號(hào)能夠反映類囊體膜的完整性[24]，然后打開光化光(1 828 μmol/(m2·s))誘導(dǎo)棉花葉片10 min，關(guān)掉光化光黑暗處理4 min，再測(cè)定P515信號(hào)吸收變化能夠反映ATP合成酶活性[25]。

測(cè)定550～515 nm信號(hào)的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變，取充分暗適應(yīng)幾個(gè)小時(shí)的棉花材料，打開光化光AL(1 828 μmol/(m2·s))誘導(dǎo)10 min后515信號(hào)趨于穩(wěn)定(玉米黃質(zhì)合成的測(cè)定)，然后關(guān)掉光化光AL，515信號(hào)先快速下降隨后上升逐漸趨于穩(wěn)定(跨類囊體膜質(zhì)子梯度的測(cè)定)[26-27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用Rstudio軟件進(jìn)行方差分析及作圖。試驗(yàn)處理間的多重比較采用“Agricolae”程序包進(jìn)行最小顯著差法(Least-significantdifference，LSD)分析，顯著水平為0.05，并用英文小寫字母標(biāo)記。圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同棉花花青素含量的差異

研究表明，綠葉棉花無花青素的存在，而紅葉棉花有明顯花青素存在，隨顏色加深，花青素含量增多。低花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT均較高花青含量的棉花低，而無花青素的棉花 Chla、Chlb、ChlT和高花青素含量棉花幾乎無差異，低花青素棉花類胡蘿卜素(Car)較高花青素棉花低，含花青素的棉花較無花青素的棉花低。圖2

圖2 不同棉花花青素含量和葉綠素含量的差異

2.2 不同花青素含量的棉花光合性能的差異

研究表明，含花青素和不含花青素的棉花Fv/Fm均無差異，各棉花可能均相應(yīng)啟動(dòng)了光保護(hù)機(jī)制。含花青素的棉花Abs較不含花青素的棉花高，含花青素的棉花吸光系數(shù)(Abs)為0.87明顯高于較不含花青素的棉花0.83，低花青素棉花Abs 0.86和高花青素棉花0.87無差異；隨花青素含量增加，凈光合速率(Pn)從31.19到31.43無差異，而無花青素的棉花Pn 34.25顯著高于含花青素的棉花31.19。表2

表2 不同花青素含量的棉花氣體交換參數(shù)變化

2.3 不同花青素含量的棉花NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性的差異

研究表明，隨花青素含量增加，熒光信號(hào)的快速上升速率顯著增強(qiáng)，而花青素含量較低的棉花和無花青素的棉花熒光信號(hào)的快速上升無明顯差異。花青素含量越高NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性越高，高花青素的棉花伴隨較強(qiáng)的NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子流。圖3

A：葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線；B：作用光關(guān)閉后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)上升

2.4 不同花青素含量的棉花ATP合成酶活性的差異

研究表明，在Before AL條件下高花青素含量的棉花和無花青素的棉花515信號(hào)緩慢上升幾乎無差異，類囊體的完整性都相對(duì)較好；而After AL條件下高花青素含量的棉花515信號(hào)快速下降的初始斜率顯著高于無花青素的棉花。高花青素含量的棉花較無花青素的棉花有較高的ATP合成酶活性，能夠合成更多的ATP，而低花青素含量的棉花和無花青素的棉花有相同的趨勢(shì)。圖4

圖4 花青素含量的差異對(duì)單周轉(zhuǎn)飽和閃光誘導(dǎo)P515的吸收變化

2.5 不同花青素含量的棉花葉黃素循環(huán)的熱耗散的差異

研究表明，在515信號(hào)暗-光誘導(dǎo)下，無花青素的棉花515信號(hào)顯著較含花青素的棉花強(qiáng)，而低花青素含量的棉花較高花青素含量的棉花強(qiáng)，在含花青素的棉花中玉米黃質(zhì)的合成速率顯著較無花青素的棉花弱，隨花青素含量的增多，玉米黃質(zhì)的合成速率變慢，花青素的存在可能抑制了玉米黃質(zhì)的合成，并且隨花青素含量的增多，抑制作用越強(qiáng)。圖5

圖5 花青素含量的差異下550～515 nm信號(hào)的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變的影響誘導(dǎo)瞬變

3 討 論

3.1 花青素含量增多伴隨葉片光合能力的減弱

花青素可通過過濾、衰減和反射高強(qiáng)度的藍(lán)紫光從而來減少光能的吸收[15、27]，可以調(diào)節(jié)葉綠素對(duì)光量子的吸收[1]。而光合色素在植物光合作用中主要起對(duì)吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的作用，其中Chlb具有捕獲和吸收光能的作用，而Chla能夠執(zhí)行能量轉(zhuǎn)換，類胡蘿卜素不僅可以作為輔助色素捕獲光能，也可以猝滅活性氧防止光合器官受損[28]。高花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT、Car均低花青素含量的高，吸光系數(shù)之間無差異，而相對(duì)無花青素的棉花而言，高花青素含量的棉花Chla、Chlb、ChlT較低，吸光系數(shù)較高，Car較低?；ㄇ嗨睾吭降停?、轉(zhuǎn)換光能的能力較弱，猝滅活性氧的能力也較弱，花青素含量的多少能夠影響植物對(duì)光能的吸收以及猝滅活性氧的能力。

分析凈光合速率，低花青素棉花的Pn與較高花青素棉花無差異，相對(duì)無花青素的棉花，有花青素的棉花Pn較弱，有花青素的存在并且隨著花青素含量逐漸增多，光合性能越弱，可能含有花青素的棉花吸收的光能被花青素吸收、過濾使得轉(zhuǎn)換為光化學(xué)的能量減弱，使得光合能力減弱。

3.2 隨花青素含量升高NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子流及其調(diào)控能力逐漸增強(qiáng)

環(huán)式電子傳遞是植物體內(nèi)重要的光合電子傳遞途徑[13、29]，研究中，很明顯高花青素含量的棉花中NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子活性顯著高于無花青素的棉花，ATP合成酶活性也較無花青素的棉花強(qiáng)；同時(shí)隨花青素含量的增加，Y(ND)逐漸增強(qiáng)，Y(NA)逐漸減弱，較強(qiáng)的環(huán)式電子能夠耗散受體側(cè)的電子，減少氧化態(tài)的P700，保護(hù)PSI免受光損傷，有效保護(hù)PSI的活性。進(jìn)一步分析高花青素含量的棉花ATP合成酶活性較低花青素含量的棉花強(qiáng)，并且高花青素含量的棉花能夠較好的保護(hù)PSII的活性。隨花青素含量的增加，棉花光合能力減弱，而吸光能力增強(qiáng)，將面臨較多的過剩激發(fā)能，花青素含量的增加伴隨環(huán)式電子流及其調(diào)控能力的增強(qiáng)，有效保護(hù)了PSI和PSII的活性。

3.3 花青素能夠起到耗散過剩光能保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用

P515信號(hào)的暗-光-暗誘導(dǎo)瞬變曲線能夠反映玉米黃質(zhì)的合成速率和類囊體腔內(nèi)H+的積累程度[26]。515光-暗誘導(dǎo)下，515信號(hào)最低點(diǎn)和穩(wěn)態(tài)點(diǎn)之間的差值能夠反映ΔpH[27]，無花青素的棉花ΔpH明顯較含有花青素的棉花高，不含花青素條件下類囊體腔內(nèi)的H+濃度顯著較高。

分布在葉片上表皮的花青素能夠阻擋強(qiáng)光[30]，Gould等[31]發(fā)現(xiàn)含花青素的葉片在受到光損傷后能夠快速恢復(fù)；Neill和Gould的工作證實(shí)，花青素可以耗散過剩激發(fā)能減少活性氧的產(chǎn)生[32]。Hughes等[33]研究證實(shí)，紅葉樹種的葉黃素循環(huán)過程較弱，更多的依賴花青素的光保護(hù)作用。

研究中，含有花青素的棉花玉米黃質(zhì)的合成速率顯著低于無花青素的棉花，可能是紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)的過程受到了影響，跨類囊體膜質(zhì)子梯度(ΔpH)也顯著低于無花青素的棉花，也就是說質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)的葉黃素循環(huán)的熱耗散在含有花青素的棉花中較弱，可能含有花青素的棉花主要依賴花青素的光破壞防御功能保護(hù)其光合機(jī)構(gòu)免受光抑制。隨花青素含量的增加，玉米黃質(zhì)的合成速率減弱，花青素越多，葉黃素循環(huán)的熱耗散越弱。相反對(duì)于無花青素的棉花來說，主要依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散維持PSII的穩(wěn)定。

綠葉棉花不含花青素，主要依賴環(huán)式電子途徑建立的ΔpH驅(qū)動(dòng)葉黃素循環(huán)的熱耗散過程保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受光損傷；而含有花青素的棉花主要依賴環(huán)式電子建立的質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)ATP合成酶合成ATP，合成D1蛋白修復(fù)PSII，減少氧自由基的傷害，另一方面花青素本身具有一定的光破壞防御功能替代了葉黃素循環(huán)的過程耗散過剩激發(fā)能，保護(hù)光合機(jī)構(gòu)。

4 結(jié) 論

隨花青素含量的增加，凈光合速率從34.25減弱至31.43，而吸光系數(shù)由0.83增加至0.87，因此，將面臨較多的過剩激發(fā)能。關(guān)關(guān)熒信號(hào)的快速上升的斜率也逐漸增強(qiáng)，并且After AL條件下515信號(hào)快速下降的初始斜率也顯著升高，光-暗反應(yīng)條件下515信號(hào)葉黃素循環(huán)的熱耗散能力逐漸減弱；無花青素的棉花515信號(hào)葉黃素循環(huán)的熱耗散顯著較含花青素的棉花強(qiáng)。含花青素的棉花可以通過花青素的耗散過程維持光合機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定，而無花青素的棉花主要通過依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散耗散過剩光能保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受損傷。