袁春華 程謨鑫 李 影 程謨國

牡丹江醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，黑龍江牡丹江 157009

缺血性腦血管病注重早期溶栓治療，使局部血液供應恢復正常，但再灌注將進一步加重缺血組織的損傷。再灌注損傷主要以神經(jīng)細胞凋亡為主[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）是促進細胞存活的重要信號通路，在腦缺血再灌注過程中能夠減輕對神經(jīng)細胞的損傷，促進神經(jīng)元細胞存活作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)丹參具有改善微循環(huán)、抗血栓、抗氧化、促進組織恢復等作用[6-7]。丹參對腦缺血再灌注損傷的臨床療效明確，但是否通過激活PI3K/Akt轉(zhuǎn)導通路對抗腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷尚不明確。通過動物實驗研究觀察丹參對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能和腦梗死體積影響及對腦組織中磷酸化AKT蛋白（phosphorylated Akt protein，p-AKT）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達情況，探討丹參治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2020年3—5月，選擇48只健康SD大鼠，體重為（240±10）g，由牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗前適應性飼養(yǎng)觀察3 d。將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹參組和LY294002組，每組12只。所有實驗動物操作均符合實驗動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1 藥品及試劑 LY294002（美國Sigma公司），兔抗大鼠 p-Akt 多克隆抗體，兔抗大鼠 Caspase-3 多克隆抗體，兔抗大鼠 HIF-1α多克隆抗體（北京博奧森生物公司），辣根酶過氧化物酶標記山羊抗兔購于北京中杉金橋，丹參購于牡丹江市同仁堂大藥房。

1.2.2 丹參提取物制備 參考文獻[8]，將丹參藥材（丹參產(chǎn)品批號：00126254）40℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍量水，提取2次，每次45 min。過濾，棄濾渣，濾液合并，過濾；溶液定容至100 ml，2000 r/min離心10 min。取上清液，將濃度調(diào)整為2.5 mg/ml備用。

1.2.3 給藥方法 丹參組灌胃給予丹參水提物進行干預，劑量為每天20 mg/kg，相當于60 kg成人的用藥20倍。LY294002組肌內(nèi)注射給予PI3K/Akt抑制劑LY294002（產(chǎn)品批號：10064321）劑量為每天2.5 μg/kg。假手術(shù)組和模型組灌胃給予丹參水提物同體積生理鹽水，均給藥7 d。

1.2.4 腦缺血再灌注模型建立 給藥7 d后，各實驗組動物按照Longa線栓法改良制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型[9]。稱量大鼠重量，按體重腹腔注射給予10%水合氯醛進行麻醉，頸前術(shù)區(qū)脫毛、消毒，沿頸部正中線切開皮膚，逐層分離暴露分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端后，在頸內(nèi)動脈上距離頸總動脈分叉處約2 mm處做一切口，從切口插入備好線栓，經(jīng)切口處插入大腦中動脈始端，栓塞大腦中動脈，造成局灶性腦缺血。缺血2 h 后拔除栓線實施再灌注24 h。假手術(shù)組暴露右側(cè)頸總動脈，不做其余處理。

1.3 評價方法

1.3.1 神經(jīng)行為學評分 按照Longa 5分制評分標準[9]進行神經(jīng)功能缺失程度評分。0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時身體向偏癱側(cè)傾倒者；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失者。

1.3.2 腦梗死體積測定 取缺血再灌注后腦組織，-20℃冷凍30 min，去除小腦、低位腦干及嗅球，腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切片5片，置于含2%的TTC的磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫箱孵育染色30 min，置于4%多聚甲醛固定24 h 后拍照。正常腦組織為紅色，梗死灶為白色，采用圖像分析軟件分析計算腦梗死體積百分比。

1.3.3 大腦組織p-AKT、Caspase3和HIF-1α水平檢測 取缺血側(cè)大腦組織100 mg置于1 ml組織細胞裂解液中，超聲細胞破碎儀低溫勻漿。12000 r/min 4℃離心15 min，取上清，取2 μl蛋白溶液利用Direct Detect? Spectrometer-Sample Measuring紅外微定量分析儀直接檢測蛋白濃度，取相同蛋白進行上樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBS-T洗膜2次，10 min/次，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后，加入p-AKT、Caspase3和HIF-1α一抗工作液，4 ℃過夜，TBS-T緩沖液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用（）表示，四組間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比較

造模后，假手術(shù)組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積均為0；LY294002組神經(jīng)功能評分最高，腦梗死體積最大，其次為模型組，丹參組最低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比較（±s）

表1 各組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比較（±s）

注：神經(jīng)功能評分：丹參組與模型組比較，t=2.095，P=0.048，LY294002組與模型組比較，t=2.750，P=0.012，LY294002組與丹參組比較，t=5.906，P=0.000；腦梗死體積：丹參組與模型組比較，t=6.318，P=0.000，LY294002組與模型組比較，t=2.431，P=0.024，LY294002組與丹參組比較，t=8.592，P=0.000

組別 n 神經(jīng)功能評分（分） 腦梗死體積（%）假手術(shù)組 12 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 12 1.83±0.68 21.63±3.16丹參組 12 1.33±0.47 14.68±2.13 LY294002組 12 2.50±0.50 24.97±3.56 F值 57.583 216.530 P值 0.000 0.000

2.2 丹參對腦缺血再灌注損傷腦組織中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白影響

腦組織中存在基礎的p-Akt和HIF-1α分泌，腦缺血再灌注后p-Akt和HIF-1α表達明顯增加；與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中p-Akt和HIF-1α表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹參組腦組織中p-Akt和HIF-1α表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，LY294002組腦組織中p-Akt表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A、B。與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中Caspase-3的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹參組腦組織中Caspase-3的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，LY294002組腦組織中Caspase-3表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1C。

圖1 腦缺血再灌注損傷腦組織中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白表達

3 討論

腦缺血再灌注恢復缺血區(qū)域血液供應將會進一步加重組織損傷和功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)預處理給予丹參后能夠明顯降低腦缺血再灌注對神經(jīng)功能損傷，降低腦梗死體積百分比，提示丹參對腦缺血再灌注損傷具有保護作用；同時預處理給予PI3K/Akt通路抑制劑LY294002能夠明顯增加腦缺血再灌注對神經(jīng)功能損傷，增加腦梗死體積，提示抑制PI3K/Akt通路的激活能夠加重腦缺血再灌注損傷。PI3K/Akt信號通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的重要途徑，對于維持細胞的生存和抑制細胞凋亡起關(guān)鍵作用，Akt是PI3K下游信號通路的主要靶點，處于中心環(huán)節(jié)，活化的Akt是發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵，具有抑制多種刺激引起的細胞凋亡作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)建立局灶性腦缺血再灌注模型能夠明顯增加p-Akt的表達，提示腦缺血再灌注能夠激活PI3K/Akt轉(zhuǎn)導通路；預處理給予丹參能夠極顯著增加p-Akt的表達，提示丹參能夠在腦缺血再灌注過程中激活PI3K/Akt轉(zhuǎn)導通路。

HIF-1α是在特定的缺氧條件下廣泛存在的一種缺氧應答調(diào)控因子，通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，使機體適應缺血或缺氧壞境，同時研究證明HIF-1α在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注過程中HIF-1α的表達明顯高于假手術(shù)組，提示腦缺血再灌注過程中HIF-1α表達增加；預處理給予丹參在腦缺血再灌注過程中HIF-1α的表達明顯高于模型組，提示給予丹參能夠進一步激活HIF-1α的表達。

Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)途徑[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)給予丹參預處理后腦缺血再灌注后Caspase-3表達明顯低于模型組，提示丹參能夠明顯降低腦缺血再灌注損傷引起神經(jīng)細胞的凋亡；給予LY294002阻斷PI3K/Akt通路的激活能夠明顯增加Caspase-3表達，提示阻斷PI3K/Akt通路促使神經(jīng)細胞凋亡。

本研究以局灶性腦缺血再灌注模型為研究對象，通過觀察丹參和PI3K/Akt通路阻斷劑LY294002對腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積影響表明丹參能夠改善腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損，降低腦梗死體積，增加腦組織中p-Akt和HIF-1α蛋白的表達，降低腦組織中Caspase-3表達，其作用機制可能為丹參激活PI3K/Akt轉(zhuǎn)導通路，增加p-Akt和HIF-1α蛋白的表達，降低Caspase-3表達有關(guān)。本研究未分析丹參中發(fā)揮缺血再灌注腦組織保護作用的具體成分，期待今后研究中能夠進一步分析。