成南南 徐 寧 楊萌哲 白先愚 郭興喆 楊建宇 呂安喬 黃元姣，▲

1.廣西醫(yī)科大學(xué)生物分子醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西南寧 530021

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平[1]，研究發(fā)現(xiàn)中藥治療NPC可起到緩解癥狀、減毒增效和提高患者生存質(zhì)量的作用[2]。中藥知母具有抗菌、抗腫瘤、解熱和抗炎等多種藥理活性[3]，知母皂苷A-Ⅲ是其藥理活性最主要的成分。近年來，研究發(fā)現(xiàn)知母皂苷A-Ⅲ對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有良好的抑制作用[4-5]，推測(cè)其為良好的抗癌中藥，但目前對(duì)NPC尚未有研究。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，深入挖掘知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制，以期為知母皂苷A-Ⅲ的進(jìn)一步研究提供方向，為臨床用藥提供循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取知母皂苷A-Ⅲ靶點(diǎn)蛋白，并消除重復(fù)和不規(guī)范的命名，標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 NPC相關(guān)疾病靶點(diǎn)的獲取和交集靶點(diǎn)的確定

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索NPC疾病相關(guān)基因，通過Venny平臺(tái)將知母皂苷A-Ⅲ的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與NPC的相關(guān)疾病靶點(diǎn)相互映射取交集，獲得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶點(diǎn)。

1.3 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將Venny圖獲取的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行可視化分析，最終獲得知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關(guān)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO（基因本體）和KEGG（京都基因與基因組百科全書）相關(guān)靶點(diǎn)通路分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.2獲取的知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，并整合化合物、通路和靶點(diǎn)蛋白繪制“化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取知母皂苷A-Ⅲ所有靶點(diǎn)，規(guī)范化后獲得81個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2 NPC相關(guān)疾病靶點(diǎn)的獲取和交集靶點(diǎn)的確定

在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取NPC疾病相關(guān)基因1758個(gè)，與知母皂苷A-Ⅲ的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相互映射，通過Venny平臺(tái)取交集，獲得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用交集靶點(diǎn)31個(gè)，見圖1。

圖1 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關(guān)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

該網(wǎng)絡(luò)包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)（Nodes）和116條邊（Edges），該圓形節(jié)點(diǎn)代表知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，其按度值（Degree）逆時(shí)針排列，邊代表不同靶點(diǎn)蛋白的相互作用關(guān)系，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能注釋

GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物過程（biological process，BP）55條，主要涉及藥物反應(yīng)、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡過程等方面；細(xì)胞組成（cellular component，CC）10條，涉及細(xì)胞膜、核漿和膜筏等方面；分子功能（molecular function，MF）13條，涉及藥物結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合和酶活性等方面；依據(jù)P＜0.01，按照P值升序排列結(jié)果前15條顯著富集的條目，見圖3。

圖3 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC GO功能注釋

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，顯著富集的通路是蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、癌癥信號(hào)通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway）和病毒致癌通路（viral carcinogenesis）等12條通路。見圖4。

圖4 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC KEGG通路富集分析

2.6 “化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

該網(wǎng)絡(luò)包含91個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes）和374條邊（edges），其中圓形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，正三角形節(jié)點(diǎn)代表通路，見圖5。

圖5 “知母皂苷A-Ⅲ-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

NPC與多種危險(xiǎn)因素相關(guān)，包括人類皰疹病毒（EB病毒）感染、遺傳因素和環(huán)境因素[6]。我國NPC發(fā)病率居全球首位，年發(fā)病率約為每10萬人30例[7]，NPC放療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和嚴(yán)重并發(fā)癥等問題丞待解決。目前，常用順鉑等常規(guī)化療藥治療，但其有多種嚴(yán)重副作用，近年來，中醫(yī)藥在防治腫瘤上備受關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明知母具有抗病原微生物、抗腫瘤和抗衰老等作用，知母皂苷A-Ⅲ是其藥理活性最主要的成分。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多靶點(diǎn)、多通路的研究思路，構(gòu)建知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，從而推測(cè)知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用機(jī)制。

通過對(duì)“知母皂苷A-Ⅲ-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖分析，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C（PRKCA）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，PRKCA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，發(fā)現(xiàn)在肺癌[8]，經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)瘤[9]，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系[10]中上調(diào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為。IGF1R通過引發(fā)Ras/Raf/MAPK（膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和惡性轉(zhuǎn)化等調(diào)控[11]，研究顯示NPC C666-1細(xì)胞系中IGF1R高度上調(diào)[12]，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和增殖能力。同時(shí)，靶向抑制IGF1R可以阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡抑制NPC細(xì)胞增殖，并且可以使NPC細(xì)胞放射敏感性增高[13]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）不僅通過降解內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)而參與新血管的形成，而且還調(diào)節(jié)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致NPC的發(fā)生發(fā)展[14-15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)抑制VEGFA表達(dá)水平可以抑制NPC CNE2細(xì)胞系侵襲能力并增強(qiáng)NPC放射敏感性。因此推測(cè)，知母皂苷A-Ⅲ可能通過單獨(dú)或共同調(diào)節(jié)PRKCA、IGF1R和VEGFA，抑制NPC的增殖、分化、侵襲遷移和放療增敏達(dá)到抗NPC的目的。

GO結(jié)果表明，知母皂苷A-Ⅲ是通過藥物結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等作用于細(xì)胞膜、核漿和膜筏等部位調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡過程，預(yù)示知母皂苷A-Ⅲ通過調(diào)控上述生物過程抑制NPC的發(fā)生和發(fā)展。KEGG結(jié)果顯示PI3K-Akt（磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）通路顯著性較高，其異常激活與NPC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究表明，miR-155通過激活PI3K-Akt，促進(jìn)NPC CNE2細(xì)胞的增殖和侵襲[17]，雷公藤甲素通過抑制PI3K-Akt上調(diào)半胱天冬酶3剪切帶（cleavedcaspase-3）和凋亡調(diào)節(jié)蛋白（Bax），下調(diào)Bcl-2抑制NPC C666-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[18]，野鴉椿酸可通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKTmTOR）上調(diào)Bax和caspase-3，下調(diào)凋亡調(diào)節(jié)蛋白（Bcl-2）和周期蛋白-D1（cyclin D1）阻滯細(xì)胞周期在G1/ S期并誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果表明，知母皂苷A-Ⅲ可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路抗NPC。

目前NPC化療藥物順鉑常伴有肝腎毒性、骨髓抑制和嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，PI3K-Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002以時(shí)間依賴性方式對(duì)正常細(xì)胞顯示毒性[20]，因此也不能成為NPC患者的臨床用藥。知母作為我國的傳統(tǒng)中藥歷史悠久，《中華人民共和國藥典》記載知母具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥的功效，知母皂苷A-Ⅲ是知母的主要成分，綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，揭示知母皂苷A-Ⅲ抗NPC是一個(gè)涉及多靶點(diǎn)、多通路的共同作用過程，推測(cè)知母皂苷A-Ⅲ可通過PRKCA、IGF1R和VEGFA等多個(gè)核心靶點(diǎn)及蛋白多糖癌癥通路、癌癥信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路干預(yù)NPC的發(fā)生發(fā)展，提示其可能起到緩解癥狀、減毒增效和提高患者生存質(zhì)量的作用，可作為NPC患者治療干預(yù)的良好中藥。

本研究也存在不足，中藥單體是多靶點(diǎn)、多通路綜合作用的結(jié)果，由于數(shù)據(jù)庫不完善以及計(jì)算機(jī)無法真實(shí)模擬體內(nèi)環(huán)境，因此本研究著重于理論分析，后期仍需要更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臨床驗(yàn)證，但這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)，指明研究方向。