宋遷甲，姚娟，燕建鋒，方舒，黃城

(1.新疆醫(yī)科大學研究生學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆石河子大學，新疆 石河子 832000)

0 引言

心房顫動(atrialfibrillation，AF，以下簡稱房顫)是近數(shù)十年來愈加熱門的心律失常疾病，現(xiàn)房顫的發(fā)病率不斷增高，老年人的房顫發(fā)病率可達3%-5%[1]，由于房顫常導致心衰和腦卒中，使住院率、病死率升高，小到家庭，大至社會均帶來了巨大的經(jīng)濟和心理負擔。異常調(diào)控的離子通道蛋白引發(fā)的離子流重構(gòu)和電重構(gòu)是房顫發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，隨著醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的不斷更新進步，與房顫相關(guān)的miRNA 的研究引起了愈多的重視。雖有一些房顫射頻消融術(shù)后患者外周血及心房組織中miRNAs 表達水平的報道[2-3]，但關(guān)于冷凍球囊消融術(shù)的上述相關(guān)研究目前國內(nèi)罕有報道，本文探討冷凍球囊消融術(shù)對調(diào)控鈉離子通道蛋白的miRNA 的影響和調(diào)控作用，分析與房顫發(fā)生發(fā)展相關(guān)的預(yù)警標志物，可能會為房顫的治療提供不同的思路與方向。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

樣本取自于2017 年1 月至2019 年10 月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的陣發(fā)性房顫患者45 例，男35 例，女 10 例，年齡(57.8±9.6)。入選標準：(1)依據(jù)國內(nèi)外通用的診斷標準[4]，根據(jù)病史、發(fā)病時癥狀、體征、ECG 或動態(tài)ECG 資料明確診斷陣發(fā)性房顫且接受冷凍消融術(shù)隨訪3 個月無復(fù)發(fā)者；排除標準：年齡＞75 歲，甲亢，糖尿病，血壓控制不良[收縮 壓＞140mmHg 和(或) 舒張壓＞90mmHg(1mmHg=0.133 kPa)]，左室功能減低(EF＜40%)，嚴重冠動疾病，肝、腎功能障礙，急、慢性感染疾病，心肌結(jié)構(gòu)性病變。患者入組后均接受血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體抑制劑(ARB)、他汀類等藥物規(guī)范控制血壓、血脂等治療。停用β阻劑和其他抗心律失常藥物，后期隨訪房顫復(fù)發(fā)者予以排除。對照組為同病區(qū)無房顫的患者15 人，男10 例，女 5 例，年齡(59.0±10.0)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集

在實驗組中，患者在冷凍消融術(shù)前空腹下分別抽取4mL外周靜脈血，對照組同期抽取相同性質(zhì)血樣4mL，分別置于EDTA 抗凝管中，2 h 之內(nèi)分離血漿，1500 r/min，離心15 min，吸上清液至凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。對于術(shù)后轉(zhuǎn)復(fù)為竇律，期間無復(fù)發(fā)的手術(shù)患者在術(shù)后3 月后我科復(fù)診，按先前同樣條件下再次采取靜脈血保存。

1.3 主要試劑及儀器

TRhol Reagent 和miRNeasv mini 試劑盒、miRCURYTM Array Power Labeling kit 標記試劑盒、CIP 和CIP buffer 的混合物(1:1)、標記緩沖液、熒光探針(Hy3a、9、DMSO 和標記酶、總RNA 提取試劑盒(上海羽朵)，DEPC 處理水(無錫菩禾)，氯仿/無水乙醇(上海國藥)，SYBRGreen PCR 試劑盒(Thermo F-415XL)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo #K1622)，紅細胞裂解液(無錫菩禾)、低溫冷凍離心機(Sigma 3K15)，Real-time 檢 測儀(ABI-7500)。

1.4 試驗方法

(1)提取RNA；(2)RNA 的提取及標記；(3)芯片雜交；(4)實時定量PCR(real—time PCR)；(5)靶基因預(yù)測：主要通過mirbase、miranda、targetscan 三大數(shù)據(jù)庫來進行miRNA 靶基因預(yù)測。利用Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫對預(yù)測結(jié)果進行信號通路歸類，然后根據(jù)GeneOntology project數(shù)據(jù)庫對靶基因參與的生化過程、細胞組分及分子功能進行分析。篩選所得靶基因至少存在于2 個數(shù)據(jù)庫中；(6)對預(yù)測的靶基因進行qRT-PCR 驗證。5 個選擇qRT-PCR 的基因引物序列如表1：

表1

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)輸入EXCEL 表格，并使用SPSS 23.0 軟件包完成。使用VolcnoPIot 法獲得差異表達，以病例組與對照組外周血比值＞1.5 倍認為是顯著上調(diào)，比值＜1.5 倍認為顯著下調(diào)，均用t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

在冠心病、糖尿病、高血壓、心力衰竭、卒中患病率對比中，實驗組明顯高于對照組，左房內(nèi)徑(LAD)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在性別、年紀、吸煙、飲酒、體重質(zhì)量指數(shù)(BMI)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分數(shù)(LVEF)、BNP 方面差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。詳見表2A、2B。

表2A

2.2 miRNA 表達譜

通過將結(jié)果與已知基因組進行比較并通過mirdeep2 軟件進行統(tǒng)計，可以獲得miRNA 表達定量，miRNA 表達閾值是將每組中的(Counts per million reads)CPM 平均值超過≥1 的miRNA 視為在該組中表達并進行統(tǒng)計分析。首先，設(shè)定閾值為1.5 倍差異，p-value ≤0.05 且組內(nèi)CPM 均值≧1 來篩選差異表達miRNA，我們分析了整個AF 組(n=45)和SR(n=15)組之間miRNA 的表達。(圖A)散點圖、(圖B)火山圖、(圖C)聚類熱圖顯示了手術(shù)后與手術(shù)前對比miRNA 顯著差異表達的變化。

表2B

圖A

2.3 miRNA 靶基因預(yù)測結(jié)果

基于靶基因數(shù)據(jù)庫，分別對差異顯著上、下調(diào)的miRNA進行靶基因篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCN5A 相關(guān)聯(lián)的miRNA hsalet-7i-5p 與房顫明顯相關(guān)，術(shù)前與術(shù)后相比明顯上調(diào)，此外，DAAM2 基因相關(guān)聯(lián)的miRNA hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關(guān)聯(lián)的miRNA hsa-miR-1255a 也顯著上調(diào)，發(fā)現(xiàn)代表KCNA5(鉀離子通道相關(guān)基因) 的miRNA hsa-miR-4433b-3p 與房顫明顯相關(guān)，術(shù)前與術(shù)后相比明顯下調(diào)。

2.4 差異表達miRNA 的qRT-PCR 驗證結(jié)果

驗證選擇了代表調(diào)控鈉離子通道蛋白miRNA 的SCN5A基因進行了qRT-PCR 驗證，其中用內(nèi)對照基因(管家基因 GAPDH)進行校正，進行相對表達量分析。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，術(shù)后SCN5A 的表達水平顯著上升，與測序結(jié)果相吻合。(*P＜0.05，**P＜0.01，與術(shù)前相比較)。如圖2A、2B。

3 討論

AF 的主要病理生理過程是心房重構(gòu)，包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)異常[5]，近年來的研究認為，異常調(diào)控的離子通道蛋白引發(fā)的離子流重構(gòu)和電重構(gòu)是房顫發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，miRNA 參與心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。在AF的動物模型、房顫患者的心臟組織和血液中都有miRNA 的異常表達，且miRNA 表達調(diào)控能增強或減弱AF 的易感性[6]。SCN5A 基因位于3q21 人類染色體并編碼心臟鈉通道 Nav1.5蛋白，主要存在心肌細胞中，該通道蛋白負責鈉離子內(nèi)向電流的峰值，影響心房、心室細胞和特殊傳導組織(浦肯野細胞等)的興奮性和傳導、再極化、晚期鈉離子通道[7]。國外有科研表明，AF 發(fā)作時，AF 患者右心耳的SCN5A／Nav 1.5 表達降低和峰值鈉電流密度降低[8]。Zhao、Huang 等研究者發(fā)現(xiàn)在房顫患者心房組織中miR-192-5p 上調(diào)，SCN5A 基因表達下調(diào)[9]。Daimi 等人發(fā)現(xiàn)，miR-219 能正向調(diào)控SCN5A 的基因和蛋白表達[10]。有研究分析，對比房顫組、對照組以及房顫復(fù)發(fā)組研究對象的外周血miRNAs 表達水平發(fā)現(xiàn)，有25 種miRNAs 在消融復(fù)律術(shù)后表達減少或増多[11]。此外，miRNA能抑制不完全互補的靶基因，一種miRNA 可以調(diào)節(jié)多個靶基因，多種miRNA 又可共同調(diào)節(jié)同一個靶基因[12]。結(jié)合本研究，在預(yù)測差異表達的miRNA 靶基因時，基于靶基因數(shù)據(jù)庫，分別對顯著差異上、下調(diào)的Top 10 miRNA 進行靶基因篩選，hsa-let-7i-5p miRNA 提示顯著上調(diào)，推測其可能與SCN5A基因、SLC1A4 基因、IGF1R 基因相關(guān)聯(lián)，隨后采用qRTPCR技術(shù)驗證SCN5A 在術(shù)后較術(shù)前明顯上調(diào)，符合上述說法。

圖B

圖C

圖2A

圖2B

隨著年齡的增長，房顫的發(fā)生率逐年上漲，即房顫的發(fā)生與年齡的增長呈正相關(guān)[13]，針對房顫的治療，藥物治療為先推薦的手段，然而在治療過程中，有些患者藥物治療效果差或不能耐受藥物相關(guān)作用，故消融技術(shù)應(yīng)運而生并不斷發(fā)揚光大，導管消融術(shù)成為上述人群的優(yōu)選治療方案。目前常用治療房顫的消融手段為射頻消融術(shù)(RFCA)和冷凍球囊消融術(shù)(CBA)，而CBA 作為一項新技術(shù)，較RFCA 學習快捷，操作簡單且術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥少，目前越來越多的的城市將其納入醫(yī)保范圍，發(fā)展前景光明。在本研究中，通過對比發(fā)現(xiàn)，hsalet-7i-5p 在術(shù)后顯著上調(diào)，采用qRT-PCR 技術(shù)驗證靶基因，結(jié)果與預(yù)測相符，可能機制為hsa-let-7i-5p 的調(diào)控使術(shù)前房顫的易感性增加，在術(shù)后使離子流和電活動發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。此外，DAAM2 基因相關(guān)聯(lián)的hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關(guān)聯(lián)的hsa-miR-1255a 在本次研究中均顯著上調(diào)，但上述基因目前與鈉離子通道是否有明確聯(lián)系，目前國內(nèi)外罕見相關(guān)文獻報道，需進一步證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA hsa-let-7i-5p 在房顫患者接受CBA 前后的表達及其含量變化可體現(xiàn)其與房顫有著千絲萬縷的聯(lián)系，hsa-let-7i-5p miRNA 可能通過對SCN5A基因的調(diào)控，參與AF 的電重構(gòu)，由于SCN5A 是心臟動作電位產(chǎn)生的關(guān)鍵，是抗心律失常治療的靶點[14]，因而miRNA hsalet-7i-5p 可能對于未來房顫的治療具有意義。但本實驗局限是只對比了陣發(fā)性房顫手術(shù)病人樣本，在不同房顫類型中miRNA hsa-let-7i-5p 表達和含量變化是否相同，尚不明確。此外，本研究沒有進一步行功能學實驗，若想進一步了解及證實miRNA hsa-let-7i-5p 對SCN5A 編碼鈉通道的功能學作用，仍需更深層次的探索，如電生理及動物實驗，對房顫發(fā)病機制的調(diào)控，治療的分子靶點的研究有重大意義。