司 蕊，章超樺,2,*，曹文紅,2，秦小明,2，鄭惠娜,2，高加龍,2，林海生,2

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院， 廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)， 廣東 湛江 524088)

水產(chǎn)品風(fēng)味主要由香氣和滋味組成，魚、蝦、貝類等水產(chǎn)品的風(fēng)味在很大程度上取決于非揮發(fā)性的呈味物質(zhì)。呈味物質(zhì)主要包括含氮類化合物(游離氨基酸、核苷酸等)和非含氮化合物(無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸等)，利用氨基酸分析儀、高效液相色譜儀、火焰原子吸收光譜等方法可進(jìn)行呈味物質(zhì)含量檢測(cè)[1]。人工感官評(píng)定和電子舌檢測(cè)是用于評(píng)價(jià)水產(chǎn)品滋味特征和強(qiáng)弱的感官分析方法，電子舌可分析水產(chǎn)品整體滋味輪廓的差異并進(jìn)行相似度分析，人工感官評(píng)定客觀、實(shí)用性強(qiáng)，兩者結(jié)合可達(dá)到區(qū)別水產(chǎn)品不同時(shí)期、不同部位及不同處理方式的特征滋味及強(qiáng)弱的目的[2]。冷凍貯藏是水產(chǎn)品運(yùn)輸和保藏的重要手段之一，但水產(chǎn)品在凍藏下會(huì)發(fā)生一系列生化變化，導(dǎo)致其品質(zhì)和重要呈味物質(zhì)含量改變[3]。目前，國(guó)內(nèi)外已有許多學(xué)者對(duì)水產(chǎn)品在凍藏過(guò)程中的品質(zhì)變化進(jìn)行了研究，但這些研究大多集中在蛋白質(zhì)的冷凍變性[4-5]、組織結(jié)構(gòu)的變化[6-7]等方面，而關(guān)于凍藏對(duì)水產(chǎn)品呈味特性影響的研究?jī)H見(jiàn)少量報(bào)道[8]。

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)是我國(guó)南方用于海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類品種之一，廣泛分布于廣東、廣西、海南等地區(qū)。取珠后的貝肉除一部分鮮食外，大部分未得到充分利用，因此貝肉高值化利用已成為目前研究的熱點(diǎn)。馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)含量豐富，粗蛋白含量占干基的74.90%，富含鮮味、甜味氨基酸[9]，是開(kāi)發(fā)天然海鮮調(diào)味料的理想原料。目前對(duì)于馬氏珠母貝的研究大多集中在水產(chǎn)養(yǎng)殖及生物活性方面，僅見(jiàn)少量關(guān)于貝肉呈味的研究[10-12]，這些研究主要是對(duì)馬氏珠母貝呈味基料工藝的探討和其主要呈味物質(zhì)含量的測(cè)定，未見(jiàn)有對(duì)凍藏貝肉呈味特性的研究。

本研究以凍藏前后的馬氏珠母貝肉為研究對(duì)象，擬采用水煮、酶解兩種方式分別制備新鮮、冷凍貝肉提取物，比較不同提取物中主要呈味物質(zhì)組成及含量的差異；通過(guò)滋味活性值評(píng)價(jià)這些呈味物質(zhì)對(duì)滋味的貢獻(xiàn)，同時(shí)結(jié)合電子舌檢測(cè)和人工感官評(píng)定綜合評(píng)價(jià)提取物的呈味特征，解析它們之間的滋味差異，探討凍藏對(duì)水產(chǎn)品風(fēng)味的影響，以期為水產(chǎn)品加工過(guò)程中的風(fēng)味控制提供理論依據(jù)，為馬氏珠母貝肉天然海鮮調(diào)味料的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝肉，購(gòu)于廣東省雷州市覃斗鎮(zhèn)養(yǎng)殖場(chǎng)，樣品采集后用蒸餾水潤(rùn)洗分裝。冷凍貝肉于-18 ℃以下緩凍保存2個(gè)月備用，新鮮貝肉立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物蛋白酶(130 000 U/g)、中性蛋白酶(80 000 U/g)，廣西南寧龐博生物工程有限公司；5′-肌苷酸(IMP，純度≥98%)、5′-鳥(niǎo)苷酸(GMP，純度≥98%)，5′-一磷酸腺苷(AMP，純度≥98%)、5′-三磷酸腺苷(ATP，純度≥95%)、5′-二磷酸腺苷(ADP，純度≥95%)、肌苷(HxR，純度≥99%)、次黃嘌呤(Hx，純度≥99%)、琥珀酸(純度≥99.5%)、乳酸(純度≥99.5% )、甜菜堿(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003型電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；HZ- 9212S型恒溫振蕩器，太倉(cāng)市科教器材廠；PB- 10型pH計(jì)，德國(guó)Sartoriu S公司；FDU- 1100型真空冷凍干燥機(jī)，日本東京理化器械株式會(huì)社；Thermo Lynx- 6000型高速落地離心機(jī)，賽默飛世爾(中國(guó))科技有限公司；VAPODEST- 450型全自動(dòng)凱氏定氮儀，德國(guó)格哈特分析儀器有限公司；UV- 2102PC型紫外分光光度計(jì)，尤尼克(上海)儀器有限公司；1200型半制備高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；SA402B型電子舌，日本Insent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備

1.3.1.1 水煮提取物制備

參考文獻(xiàn)[13]的方法，分別取新鮮、冷凍貝肉，洗凈瀝干，按料液比(mg∶mL)1∶3加水打漿，均質(zhì)后，加熱煮制，待中心溫度達(dá)到95 ℃后保持20 min。加熱結(jié)束迅速冷卻至室溫，于4 ℃下8 000 r/min離心20 min，過(guò)濾。取上清液冷凍干燥，分別得到新鮮貝肉水煮提取物(Fresh PMWs)、冷凍貝肉水煮提取物(Freeze PMWs)。

1.3.1.2 酶解提取物制備

分別取新鮮、冷凍貝肉，洗凈瀝干，按料液比(mg∶mL)1∶3加水打漿，均質(zhì)后，調(diào)pH值至7.00，酶解溫度55 ℃。選擇前期優(yōu)化后的復(fù)合酶解條件進(jìn)行酶解(總加酶量3 000 U/g，動(dòng)物蛋白酶與中性蛋白酶之比為1∶1)，將動(dòng)物蛋白酶水解2 h后水浴滅酶10 min，再加入中性蛋白酶水解3 h，水浴滅酶10 min，迅速冷卻到室溫。將酶解液于4 ℃下8 000 r/min離心20 min，過(guò)濾，取上清液冷凍干燥，分別得到新鮮貝肉酶解提取物(Fresh PMHs)、冷凍貝肉酶解提取物(Freeze PMHs)。

1.3.2基本成分測(cè)定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法進(jìn)行測(cè)定，灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》中高溫灼燒法進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定，總糖含量參照GB/T 9695.31—2008《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 肉制品總糖含量測(cè)定》中分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3主要呈味物質(zhì)檢測(cè)

1.3.3.1 游離氨基酸測(cè)定

參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.2 呈味核苷酸測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法并加以改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取樣品0.20 g，超純水溶解定容于10 mL容量瓶；準(zhǔn)確吸取5 mL樣品溶液，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為6%的冷高氯酸，超聲震蕩5 min，4 ℃下8 000 r/min離心20 min，取上清液；采用10 mol/L KOH調(diào)pH值至6.50，在冰箱里靜置30 min沉淀鉀鹽，過(guò)濾取上清液，超純水定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC條件：5 C18- MS- Ⅱ型色譜柱(4.60 mm×250 mm, 5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A為0.05 mol/L、pH值為6.50的KH2PO4- K2HPO4緩沖液，流動(dòng)相B為流動(dòng)相A與色譜級(jí)甲醇(二者體積比為9∶1)的混合液，流速為0.70 mL/min。梯度洗脫程序：0～14 min，流動(dòng)相A為100%；14～18 min，流動(dòng)相B由0增至25%；18～22 min，流動(dòng)相B由25%增至90%；25 min，流動(dòng)相B增至100%，保持流動(dòng)相B洗脫25 min。

1.3.3.3 有機(jī)酸測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]的方法：準(zhǔn)確稱取3.00 g樣品，用30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH值為2.5的 NH4H2PO4溶液混勻，超聲振蕩20 min，4 ℃下8 000 r/min離心30 min，取上清液；沉淀再加入20 mL pH值為2.5的NH4H2PO4溶液，超聲振蕩5 min，離心后合并上層清液，定容于50 mL容量瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC條件：5 C18- MS- Ⅱ型色譜柱(4.60 mm×250 mm, 5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH值為2.5的NH4H2PO4溶液，流速為0.70 mL/min。

1.3.3.4 甜菜堿測(cè)定

采用雷氏鹽結(jié)晶比色法，參照文獻(xiàn)[16]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g，加入蒸餾水10～20 mL，蒸煮攪拌，冷卻到室溫后加入150 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4 ℃放置12 h后，于4 ℃下8 000 r/min離心20 min。用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗滌沉淀，合并上清液，濃縮后定容，即為樣品制備液。移取5 mL樣品制備液，冰浴15 min后濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.00，制備液中甜菜堿含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]的方法。

1.3.4滋味活性值定義

滋味活性值(taste activity value, TAV)反映了單一化合物對(duì)整體味覺(jué)特征的貢獻(xiàn)，定義為滋味物質(zhì)的濃度與該物質(zhì)的呈味閾值的比值[17]。當(dāng)TAV<1時(shí)，判定為該物質(zhì)對(duì)味道貢獻(xiàn)不大，當(dāng)TAV>1時(shí)，該物質(zhì)對(duì)味道貢獻(xiàn)較大，且數(shù)值越大，貢獻(xiàn)越大。

1.3.5感官檢測(cè)

1.3.5.1 電子舌檢測(cè)

電子舌系統(tǒng)由6個(gè)味覺(jué)傳感器組成：CA0(酸)、C00(苦)、AE1(澀)、AAE(鮮)、CT0(咸)及GL1(甜)。首次檢測(cè)，所有傳感器需放在參比溶液(0.30 mmol/L酒石酸和30.00 mmol/L氯化鉀混合溶液)中活化一天，待傳感器完成自檢，信號(hào)穩(wěn)定，認(rèn)為數(shù)據(jù)有效[18]。

待測(cè)樣品配成質(zhì)量濃度為1.00 g/L，按照系統(tǒng)預(yù)定程序進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做4次循環(huán)，去掉第1次循環(huán)(測(cè)定甜味時(shí)，每個(gè)樣品做5次循環(huán)，去掉前兩次循環(huán))，取后3次測(cè)量結(jié)果。以參比溶液、0.50 g/L谷氨酸鈉溶液作為對(duì)照，運(yùn)用系統(tǒng)自帶程序?qū)y(cè)試樣品的電勢(shì)值轉(zhuǎn)化為味覺(jué)值后進(jìn)行味覺(jué)特征分析。

1.3.5.2 人工感官評(píng)定

參考文獻(xiàn)[19]的方法并做適當(dāng)修改。感官評(píng)定小組成員由3名男性和5名女性組成(年齡在21～25)，均為研究室成員，各評(píng)定員均以參比溶液進(jìn)行感官訓(xùn)練。參比溶液組成：甜味(蔗糖溶液，質(zhì)量濃度分別為4.00、8.00、12.00 g/L)、酸味(檸檬酸溶液，質(zhì)量濃度分別為0.10、0.30、0.50 g/L)、咸味(氯化鈉溶液，質(zhì)量濃度分別為0.40、0.80、1.20 g/L)、鮮味(谷氨酸鈉溶液，質(zhì)量濃度分別為1.00、4.00、8.00 g/L)、苦味(L-異亮氨酸溶液，質(zhì)量濃度分別為2.00、4.00、8.00 g/L)。實(shí)驗(yàn)在(25±2) ℃感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行。

待評(píng)樣品配成質(zhì)量濃度為1.00 g/L，用專業(yè)鼻夾將評(píng)定員鼻子夾住，以排除氣味的干擾。評(píng)定員漱口后，取待評(píng)樣品2～3 mL于口中，10 s后吐出，再次漱口后取參比溶液品嘗。參比液3種濃度依次代表風(fēng)味弱、一般、強(qiáng)三個(gè)等級(jí)，分值分別為3、6、9。以此標(biāo)度對(duì)提取物的酸、甜、苦、咸、鮮進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果取各評(píng)定值的平均值。另外，感官評(píng)定時(shí)，每個(gè)評(píng)定員須描述每次呈給樣品的滋味特性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 電子舌檢測(cè)及人工感官評(píng)定結(jié)果分析

食物的呈味是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，呈味化合物含量高低不能代表整體呈味特點(diǎn)，故采用電子舌和感官評(píng)定方法進(jìn)行輔助評(píng)價(jià)。電子舌檢測(cè)樣品的味覺(jué)值以參比溶液的味覺(jué)值為對(duì)照值，即無(wú)味點(diǎn)；將酸味的無(wú)味點(diǎn)定義為-13，咸味的無(wú)味點(diǎn)定義為-6，即樣品的酸咸味覺(jué)值分別低于-13、-6時(shí)，樣品無(wú)該味道，反之則有；其余味覺(jué)指標(biāo)以0值及以下為無(wú)味點(diǎn)[20]。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的味覺(jué)響應(yīng)值見(jiàn)圖1。由圖1可知，4種提取物的咸味值小于-6，酸味值小于-13，澀味回味值和苦味回味值小于0，分別低于各自的無(wú)味點(diǎn)，說(shuō)明提取物無(wú)這4種味道；故取高于各自無(wú)味點(diǎn)的鮮味、甜味、澀味、苦味及豐富度(鮮味的回味，反映了鮮味的殘留情況)作為有效味覺(jué)指標(biāo)。

圖2 凍藏前后馬氏珠母貝肉水煮提取物電子舌檢測(cè)與人工感官評(píng)定味覺(jué)雷達(dá)圖Fig.2 Electronic tongue effective taste detection and sensory evaluation radar chart of aqueous extract of Pinctada martensii during frozen storage

圖1 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的味覺(jué)響應(yīng)值Fig.1 Taste response value of different extracts from Pinctada martensii during frozen storage

凍藏前后馬氏珠母貝肉水煮提取物電子舌檢測(cè)有效味覺(jué)指標(biāo)雷達(dá)圖與人工感官評(píng)定味覺(jué)雷達(dá)圖見(jiàn)圖2。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物人工感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。由圖2(a)可知，F(xiàn)resh PMWs的甜味值最大，根據(jù)韋伯定律，電子舌味覺(jué)響應(yīng)值的大小直接反映該味道的強(qiáng)弱[20]，因此Fresh PMWs甜味最強(qiáng)。由圖2(b)可知，F(xiàn)resh PMWs鮮甜味較強(qiáng)，酸味、苦味及咸味很弱，可以推論是其含有的谷氨酸、甘氨酸和琥珀酸等呈味物質(zhì)共同作用的結(jié)果。Fresh PMWs甜味值高于Freeze PMWs，其他味覺(jué)值無(wú)差異，且由表1可知，F(xiàn)reeze PMWs酸味高于Fresh PMWs，綜合說(shuō)明冷凍貝肉煮湯后的滋味不如新鮮貝肉。感官評(píng)定結(jié)果與電子舌結(jié)果具有不完全一致的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)闃悠繁旧砦兜缽?fù)雜以及味覺(jué)參比溶液的選擇、人體感知與儀器檢測(cè)具有差異等原因。

凍藏前后馬氏珠母貝肉酶解提取物電子舌檢測(cè)有效味覺(jué)指標(biāo)雷達(dá)圖與人工感官評(píng)定味覺(jué)雷達(dá)圖見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知，F(xiàn)resh PMHs甜味值最大，其次是豐富性；由圖3(b)可知，F(xiàn)resh PMHs鮮味、甜味值均較大，說(shuō)明Fresh PMHs具有濃郁鮮甜味的特點(diǎn)，可以推論出是谷氨酸、呈鮮核苷酸及琥珀酸等物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。電子舌檢測(cè)Fresh PMHs的甜味值和豐富性值高于Freeze PMHs，其他味覺(jué)值無(wú)差異，說(shuō)明Fresh PMHs比Freeze PMHs味道更鮮美，這可能與Freeze PMHs中苦味氨基酸、核苷酸含量增加，鮮甜味氨基酸及琥珀酸含量降低有關(guān)。

圖3 凍藏前后馬氏珠母貝肉酶解提取物電子舌檢測(cè)與人工感官評(píng)定味覺(jué)雷達(dá)圖Fig.3 Electronic tongue effective taste detection and sensory evaluation radar chart of enzymolysis extract of Pinctada martensii during frozen storage

表1 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物 人工感官評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of sensory evaluation of different extracts from Pinctada martensii during frozen storage

電子舌采集的多維數(shù)據(jù)無(wú)法直觀分析不同提取物之間的味覺(jué)差異，因而采用 PCA 降低數(shù)據(jù)維度，達(dá)到識(shí)別目的。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物電子舌檢測(cè)二維主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，二維主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到98.16%，表明數(shù)據(jù)足以代表原始數(shù)據(jù)信息，不同樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)無(wú)重疊，說(shuō)明電子舌可以區(qū)分4種樣品[21]；Fresh PMHs與谷氨酸鈉較為接近，說(shuō)明Fresh PMHs最為接近谷氨酸鈉的呈味特性。

圖4 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物電子舌 檢測(cè)二維主成分分析結(jié)果Fig.4 Results of two-dimensional principal component analy-sis of different extracts from Pinctada martensii during frozen storage

2.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分分析

凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，馬氏珠母貝肉提取物具有高蛋白、低脂肪的基本特征。水煮時(shí)，得到的是游離氨基酸、核苷酸、多糖等，特別是多糖和灰分占比較高；而酶解后，可溶性蛋白增多，蛋白質(zhì)占比增大。與新鮮貝肉提取物相比，冷凍貝肉提取物粗脂肪、灰分含量顯著增加(P<0.05)，總糖含量顯著下降(P<0.05)，粗蛋白含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，這與Songsaeng等[22]對(duì)冷凍牡蠣蛋白含量變化的研究結(jié)論一致。

2.3 主要呈味物質(zhì)含量分析

2.3.1游離氨基酸含量分析

游離氨基酸是一類重要的呈味成分，對(duì)水產(chǎn)品風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。根據(jù)氨基酸的呈味特性可將其分為鮮味、甜味、苦味及無(wú)味四類氨基酸[23]。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的游離氨基酸含量及TAV見(jiàn)表3。由表3可知，冷凍前后貝肉水煮提取物分別檢測(cè)到8種、13種氨基酸。Fresh PMWs總氨基酸含量為98.10 g/kg，鮮味、甜味氨基酸含量占總氨基酸含量的81.4%，特別是谷氨酸和甘氨酸，分別占總量的16.92%和43.32%；Freeze PMWs總氨基酸含量為89.00 g/kg，較Fresh PMWs甜味氨基酸總含量下降，尤其是甘氨酸，含量從42.50 g/kg下降到23.20 g/kg。Fresh PMHs總氨基酸含量為257.50 g/kg，是水煮提取物的2倍多，鮮味、甜味氨基酸含量占總氨基酸含量的41.55%;與Fresh PMHs相比，F(xiàn)reeze PMHs鮮味、甜味氨基酸含量明顯減少，其中鮮味氨基酸總含量從34.90 g/kg減少到27.80 g/kg；Fresh PMHs中谷氨酸含量最高(27.60 g/kg)，高于克氏原螯蝦酶解液和雞肉酶解液中谷氨酸含量(16.74、0.29 g/kg)[24-25]。研究表明，凍藏過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及其體積變化導(dǎo)致解凍后水溶性風(fēng)味物質(zhì)大量損失[26]，這可能是提取物中鮮、甜味氨基酸含量減少的原因。

表2 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物基本營(yíng)養(yǎng)成分含量比較Tab.2 Comparison of basic components in different extracts from Pinctada martensii during frozen storage %

表3 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的游離氨基酸含量及TAVTab.3 Content of free amino acid and TAV of different extracts from Pinctada martensii during frozen storage g/kg

通過(guò)各氨基酸的TAV，可直觀了解各呈味氨基酸對(duì)整體滋味的貢獻(xiàn)情況。由表3可知，F(xiàn)resh PMWs中Glu的TAV最高(53.33)，其次是Gly(32.70)，說(shuō)明Glu和Gly對(duì)Fresh PMWs的鮮甜味具有重要貢獻(xiàn)；Freeze PMWs中苦味氨基酸的種類和含量較Fresh PMWs增加，原本低于閾值濃度的Val、Phe、Leu含量增加至閾值濃度以上，即對(duì)味感的貢獻(xiàn)增加，呈甜味的Gly和Pro的TAV減小，可以推測(cè)，這是冷凍貝肉煮湯后的滋味不如新鮮貝肉的原因之一。Fresh PMHs中Glu的TAV最高(92.00)，其次是Arg(44.20)和Ala(35.50)，Arg雖是苦味氨基酸，但具有一定的提鮮作用；Freeze PMHs各類氨基酸的TAV較Fresh PMHs均減小，對(duì)滋味貢獻(xiàn)下降，這可能是導(dǎo)致冷凍貝肉酶解提取物不如新鮮貝肉酶解物味道鮮美的原因之一。

2.3.2核苷酸含量分析

核苷酸類物質(zhì)是水產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生的主要因素之一，可以與某些氨基酸類物質(zhì)協(xié)同增鮮，尤其是IMP、GMP和AMP，是主要呈鮮核苷酸[28]，HxR、Hx為苦味核苷酸[29]。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的核苷酸含量見(jiàn)圖5。由圖5可知，F(xiàn)resh PMWs共檢測(cè)到5種核苷酸，鮮味核苷酸總量占核苷酸總量的77.17%，其中AMP占核苷酸總量的60.75%。由AMP大量積累可以推測(cè)出，馬氏珠母貝肉ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的主要降解途徑為ATP→ADP→AMP→腺苷(AdR)→HxR→Hx。高溫短時(shí)的加熱方式可以減緩IMP降解[30]，因此Fresh PMWs中檢測(cè)到少量IMP，說(shuō)明馬氏珠母貝肉還存在降解途徑ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx。Freeze PMWs鮮味核苷酸總量小于Fresh PMWs，其中AMP在脫氨酶的作用下發(fā)生降解，生成大量苦味核苷酸。Wang等[31]將牡蠣在-20 ℃下貯藏12周后，HxR含量升高，與本研究結(jié)果一致。Fresh PMHs中鮮味核苷酸含量占核苷酸總量的27.67%，遠(yuǎn)低于新鮮貝肉水煮提取液中鮮味核苷酸含量，說(shuō)明水煮更有利于鮮味核苷酸的釋放，未檢測(cè)到IMP，可能是酶解方式有利于IMP降解；Freeze PMHs較Fresh PMHs 苦味核苷酸含量增加，尤其是Hx占核苷酸總量的41.25%。

圖5 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的核苷酸含量Fig.5 Content of nucleotide in different extracts of Pinctada martensii during frozen storage

對(duì)3種已知閾值的呈鮮核苷酸TAV進(jìn)行比較，凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的呈鮮核苷酸含量及TAV值見(jiàn)表4。由表4可知，4種提取物中GMP、IMP和AMP的TAV均大于1，對(duì)滋味具有一定貢獻(xiàn)。Fresh PMWs中AMP的TAV最大(6.05)，GMP和IMP的TAV均低于Freeze PMWs，可以推論，AMP是使新鮮水煮提取物鮮味強(qiáng)度高于冷凍水煮提取物的最主要核苷酸。研究表明，低濃度的AMP(0.50～1.00 mg/g)僅對(duì)甜味有影響而對(duì)鮮味無(wú)影響[30]，因此AMP在Fresh PMHs中對(duì)甜味貢獻(xiàn)較大，而在Freeze PMHs中對(duì)鮮味貢獻(xiàn)較大。Fresh PMHs中GMP的TAV高于Freeze PMHs，說(shuō)明GMP是使新鮮酶解提取物鮮味強(qiáng)度高于冷凍酶解提取物的最主要核苷酸。

表4 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的呈鮮核苷酸含量及TAV

2.3.3有機(jī)酸、有機(jī)堿含量分析

海產(chǎn)品中有機(jī)酸類鮮味物質(zhì)主要有乳酸和琥珀酸，這些有機(jī)酸對(duì)風(fēng)味有特殊貢獻(xiàn)[27]。甜菜堿在硬蛤、牡蠣等中均有存在，具有爽快的鮮甜味。凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的有機(jī)酸、有機(jī)堿含量及TAV見(jiàn)表5。由表5可知，與Freeze PMWs相比，F(xiàn)resh PMWs中琥珀酸和甜菜堿含量顯著升高(P<0.05)，乳酸含量較低(397.00 mg/100 g)；水提物中3種物質(zhì)的TAV均大于1，說(shuō)明其對(duì)鮮甜味具有一定貢獻(xiàn)。凍藏前后馬氏珠母貝肉酶解提取物中琥珀酸含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，TAV較高(124.11～127.61)，說(shuō)明琥珀酸對(duì)酶解提取物風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)；與Fresh PMHs相比，F(xiàn)reeze PMHs中甜菜堿損失近51.58%，甜菜堿由于閾值低，對(duì)味感貢獻(xiàn)相對(duì)較大。研究發(fā)現(xiàn)，縊蟶在貯藏過(guò)程中甜菜堿含量先上升后下降[33]，與本研究呈現(xiàn)相同規(guī)律，但目前對(duì)于甜菜堿代謝途徑及低溫貯藏期甜菜堿含量變化尚不明確。

表5 凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物的有機(jī)酸、有機(jī)堿含量及TAVTab.5 Content of organic acid, organic base and TAV of different extracts from Pinctada martensii during frozen storage mg/100g

有機(jī)酸、有機(jī)堿含量以干物質(zhì)計(jì)，ND表示成分未檢測(cè)出；同行數(shù)據(jù)不同上標(biāo)字母表示各樣品之間存在顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本研究表明，凍藏前后馬氏珠母貝肉不同提取物主要呈味物質(zhì)的組成及含量具有一定差異，對(duì)其呈味有重要影響。凍藏處理會(huì)導(dǎo)致貝肉提取物中鮮甜味物質(zhì)(鮮味氨基酸、甜味氨基酸、琥珀酸、甜菜堿)含量降低，苦味物質(zhì)(苦味氨基酸、Hx、HxR)含量升高。冷凍貝肉水煮提取物中Gly和AMP含量較新鮮貝肉水煮提取物分別減少了19.30 g/kg、302.60 mg/100 g，苦味物質(zhì)Val、Phe、Lev、HxR及Hx含量增加，對(duì)整體滋味負(fù)面影響增大。冷凍貝肉水煮提取物中琥珀酸、甜菜堿含量顯著低于新鮮貝肉水煮提取物(P<0.05)。冷凍貝肉酶解提取物中Glu、Ala、Arg、琥珀酸及甜菜堿含量顯著低于新鮮貝肉酶解提取物(P<0.05)。電子舌味覺(jué)特征檢測(cè)和人工感官評(píng)定結(jié)果綜合表明，冷凍貝肉提取物較新鮮貝肉提取物甜味和鮮味強(qiáng)度減弱，酸味更突出，并帶有刺激性。

本研究探討了凍藏對(duì)水煮及酶解馬氏珠母貝肉提取物呈味特性的影響，希望為水產(chǎn)品加工過(guò)程中的風(fēng)味控制提供理論參考，為馬氏珠母貝肉天然海鮮調(diào)味料的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。