侯彤瑤，王宗義，潘曉玉，張麗萍，劉 珊，吳天俁

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量安全北京實驗室/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室， 北京 102206)

N-亞硝胺(N-nitrosamines)是一類重要的致癌性食品污染物[1]，主要由亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)作用生成[2-3]。調(diào)查顯示，魚類加工食品容易受到此類物質(zhì)的污染[4]，其食品安全風(fēng)險值得關(guān)注。我國水產(chǎn)動物食品中N-二甲基亞硝胺(NDMA)的安全限量為4 μg/kg[5]，其他N-亞硝胺類物質(zhì)，尚未規(guī)定限量。

目前，檢測樣品中痕量N-亞硝胺的有效方法，主要是色譜與串聯(lián)質(zhì)譜[6-8]或高分辨質(zhì)譜[9]的聯(lián)用技術(shù)。由于食品基質(zhì)相對復(fù)雜，目標(biāo)物含量低，通常N-亞硝胺的檢測需要對樣品進(jìn)行有效提取、凈化和濃縮，且還需要有效控制部分目標(biāo)物的揮發(fā)損失；而經(jīng)典的水蒸氣蒸餾- 液液萃取- 氮吹濃縮方法[10]則較為費時費力, 批量樣品篩查檢測的壓力較大。分散固相萃取[11]、活性炭柱固相萃取[12-13]、QuEChERS技術(shù)[4,14-15]和分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)[16-18]是近年來報道的較為有效的改進(jìn)方法。其中DLLME是將微升級高密度提取劑，在分散劑的作用下分散到樣品溶液中，形成乳濁液，從而擴大相界面，實現(xiàn)高效萃取，離心分離萃取劑后，樣品直接用于檢測的方法。DLLME具有成本低、操作簡單、富集倍數(shù)大和環(huán)境污染小的特點[19]；但經(jīng)典DLLME方法常用的四氯化碳、三氯甲烷等提取劑，毒性仍相對較大，并且四氯化碳對N-亞硝胺等極性相對較大的化合物萃取效果較差。研究報道，在高濃度鹽輔助和不使用分散劑的條件下，毒性相對較低、極性稍大的二氯甲烷也可做萃取劑，其與水溶液形成乳濁液，實現(xiàn)對極性相對較大的目標(biāo)物的有效萃取，即鹽輔助分散液液微萃取(salt-assisted dispersive liquid-liquid microextraction, SADLLME)方法[20]，從而補充了經(jīng)典DLLME方法的不足。但關(guān)于使用SADLLME檢測N-亞硝胺的方法還少有報道。

本研究利用氫氧化鋇溶液處理法將N-亞硝胺轉(zhuǎn)移至水溶液，進(jìn)一步優(yōu)化SADLLME參數(shù)，再結(jié)合氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)的高選擇性、高靈敏性和同位素內(nèi)標(biāo)定量的準(zhǔn)確性，旨在建立一種針對即食魚制品的樣品前處理簡單、成本低廉，對人員、環(huán)境更為友好的適合7種N-亞硝胺的SADLLME-GC-MS/MS檢測新方法，希望為簡化食品中N-亞硝胺檢測方法提供新的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

即食魚制品，北京地區(qū)超市；50 mL塑料離心管，BD Biosciences公司。

分析純八水合氫氧化鋇、硫酸鈉、四氯化碳、三氯甲烷等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷、甲醇，色譜純，美國J.T.Baker公司；質(zhì)量濃度2 000 mg/L的7種N-亞硝胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國O2si公司；質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的N-亞硝二甲胺-d6(NDMA-d6)、N-亞硝二丙胺-d14(NDPA-d14)、N-亞硝基吡咯烷-d8(NPYR-d8)的甲醇溶液，美國Accustandard Inc公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C型氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、量程為1.0 mL精密注射器，美國Agilent Technologies公司； Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；MS200型自動多管渦旋混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；800A型樣品均質(zhì)機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

定值混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和3種定值內(nèi)標(biāo)溶液，分別經(jīng)甲醇稀釋得到200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和100 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備液(棕色貯液瓶，-18 ℃儲存)，再進(jìn)一步稀釋至質(zhì)量濃度分別為1.0、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液和質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8內(nèi)標(biāo)混合液。最后，用二氯甲烷稀釋，得到質(zhì)量濃度為1、5、10、25、50、100 ng/mL和內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2樣品前處理

1.3.2.1 樣品的提取

稱取經(jīng)均質(zhì)的即食魚干樣品5.0 g于50 mL塑料離心管中，加入1 μg /mL的3種穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液50 μL，靜置5 min，加入1 g氫氧化鋇，35 mL純水，擰緊蓋子，混勻渦旋30 s，于90 ℃烘箱中處理2 h(處理30 min時取出渦旋混勻1次)。取出稍冷，直接置于離心機中8 000 r/min離心10 min，上清液完全傾入另一預(yù)先裝有7 g硫酸鈉的50 mL的離心管中，擰緊蓋子，手動搖勻至反應(yīng)充分，再于8 000 r/min離心10 min，上清液完全傾入另一50 mL的離心管中備用。

1.3.2.2 SADLLME處理

注射器吸取500 μL二氯甲烷，快速打入1.3.2.1節(jié)中溶有硫酸鈉的樣品提取液中，形成乳濁液，并于自動多管渦旋混合器上渦旋5 min，再以8 000 r/min離心10 min, 棄去部分體積的水相后，移液槍吸取下層二氯甲烷100 μL于帶有體積為200 μL內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中待測。

1.3.2.3 加標(biāo)回收實驗樣品處理

按1.3.2.1節(jié)的方法稱取樣品后，分別加入0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25、50 μL和1 μg/mL內(nèi)標(biāo)混合溶液各50 μL，即加標(biāo)水平分別為1、5、10 μg/kg，再繼續(xù)按1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)方法進(jìn)行處理，每個水平重復(fù)6次。

1.3.3分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAXUI色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm )；升溫程序：初始溫度35 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至90 ℃，30 ℃/min 升至240 ℃保持6 min；載氣(He)流速0.9 mL/min，恒流模式；進(jìn)口樣溫度190 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；溶劑延遲5 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，采集模式為多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，參數(shù)見表1。

表1 N-亞硝胺的MRM參數(shù)Tab.1 MRM parameters of N-nitrosamines

1.3.4定性、定量方法

定性分析通過核對目標(biāo)物與相應(yīng)標(biāo)樣的保留時間、前級離子、碎片離子及豐度比進(jìn)行；定量分析使用內(nèi)標(biāo)法，其中NDMA以NDMA-d6為內(nèi)標(biāo)，NDEA和NPYR以NPYR-d8為內(nèi)標(biāo), 其他均以NDPA-d14為內(nèi)標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用MassHunter B.07.01軟件和Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

SADLLME方法需要樣品中目標(biāo)物有效轉(zhuǎn)移至水溶液中，對于即食魚制品，有效的提取方法有水蒸氣蒸餾[11]、高壓熱水處理[21]、氫氧化鈉溶液(或含甲醇)[18]或飽和氫氧化鋇溶液皂化處理[13]；其中水蒸氣蒸餾費時、費力，高壓水處理需專門的設(shè)備，堿溶液皂化處理相對簡單；而使用飽和氫氧化鋇溶液則更為簡單，樣品溶液不黏稠，不需使用蛋白沉淀劑處理，僅需加入一次固體氫氧化鋇即可完成。本研究在使用氫氧化鋇處理的基礎(chǔ)上[14]，離心后加入過量硫酸鈉，再經(jīng)離心除去生成的硫酸鋇，使樣品溶液得到進(jìn)一步凈化，同時過量的硫酸鈉可作為下一步SADLLME方法的鹽輔助劑，有效簡化了樣品提取方法。

2.2 輔助用鹽的確定及用量的優(yōu)化

為便于觀察乳濁液的形成情況，研究首先使用30 mL鹽濃度均為1 mol/L的水溶液(N-亞硝胺加標(biāo)量100 ng)，按1.3.2.2節(jié)的方法比較了硫酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉和磷酸二氫鈉4種常用鹽的效果。結(jié)果顯示：4種鹽均能促使二氯甲烷與水溶液形成乳濁液，響應(yīng)值除氯化鈉最低外，其他鹽均有足夠的強度，但以硫酸鈉最高，見圖1。這主要是相同物質(zhì)的量濃度下，氯化鈉溶液的離子強度最小，鹽析效應(yīng)較差?？紤]使用硫酸鈉容易獲得較大的離子強度，同時可與樣品提取液中的氫氧化鋇形成硫酸鋇沉淀，有輔助進(jìn)一步凈化樣品溶液的作用，故本研究以硫酸鈉為輔助用鹽。

圖1 不同輔助用鹽的效果比較Fig.1 Comparison of effects of different auxiliary salts

實驗進(jìn)一步按1.3.2.1節(jié)方法對硫酸鈉用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖2。當(dāng)硫酸鈉用量為5～7 g時，響應(yīng)值趨于平穩(wěn)，進(jìn)一步提高硫酸鈉用量時，溶液達(dá)到飽和，會有結(jié)晶沉淀析出，不利于萃取劑的分離?？紤]沉淀鋇離子需要消耗一定量硫酸鈉，故確定用量為7 g。

圖2 硫酸鈉用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of sodium sulfate dosages

2.3 萃取劑體積的優(yōu)化

同樣使用1.3.2.1節(jié)得到樣品溶液(加標(biāo)量為100 ng)對二氯甲烷體積進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖3。當(dāng)二氯甲烷用量小于200 μL時，離心后體積過小；用量為300～600 μL時，目標(biāo)物響應(yīng)值變化不大。為便于離心后取出和自動進(jìn)樣分析(體積需大于50 μL)，確定二氯甲烷用量為500 μL。

圖3 二氯甲烷用量的優(yōu)化Fig.3 Optimization of dichloromethane dosages

pH值亦對N-亞硝胺的萃取有影響，但影響不十分顯著[17]。由于酸性條件有利于可能存在的胺和亞硝酸鹽反應(yīng)形成新的N-亞硝胺[2]；但本研究的樣品溶液為堿性，故未對pH值的影響進(jìn)一步討論。

2.4 SADLLME與DLLME萃取效果的比較

使用1.3.2.1節(jié)處理得到的樣品溶液(加標(biāo)量為100 ng，其中用于DLLME的樣品溶液不加硫酸鈉)，分別進(jìn)行SADLLME和DLLME[19-20]，其中DLLME使用三氯甲烷和乙醇、四氯化碳和甲醇分別做萃取劑和分散劑，每組平行測定4次，見圖4。結(jié)果顯示：同等實驗條件下，SADLLME方法的萃取效果總體優(yōu)于經(jīng)典的DLLME方法。

圖4 SADLLME與DLLME方法萃取N-亞硝胺 效果的比較Fig.4 Comparison of SADLLME and DLLME for extraction effects of N-nitrosamines

2.5 SADLLME方法對色譜和質(zhì)譜檢測的影響

考察3種不同品牌的魚干制品，發(fā)現(xiàn)在本研究確定的堿處理結(jié)合SADLLME方法和優(yōu)化的色譜分離與質(zhì)譜檢測條件下，各類N-亞硝胺均不受共同流出物的干擾，典型MRM色譜見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品及一種魚干樣品的MRM色譜Fig.5 MRM chromatograms of standards and one dried fish sample

2.6 檢出限、定量限、線性關(guān)系和回收率分析

檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別在定性離子色譜峰可有效識別的前提下，以實際樣品和低水平加標(biāo)樣品分析物的信噪比約為3和10進(jìn)行評估[22]，結(jié)果見表2。LOD為0.10～0.19 μg/kg，LOQ為0.28～0.56 μg/kg，參照水產(chǎn)品中NDMA安全限量4 μg/kg，本方法的檢出能力滿足N-亞硝胺監(jiān)測的需要。根據(jù)樣品SADLLME萃取液的目標(biāo)物可能質(zhì)量濃度，對1～100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行考察，線性良好，R2>0.997。根據(jù)實際即食魚制品中N-亞硝胺的含量水平，進(jìn)行1、5、10 μg/kg的加標(biāo)回收實驗，回收率為79.19%～117.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.06%～10.30%，見表3。

表2 目標(biāo)物的線性關(guān)系、檢出限和定量限Tab.2 Linearity，limits of detection and limits of quantitation of analytes

表3 樣品中7種N-亞硝胺的回收率及精密度Tab.3 Recoveries and precisions of seven N-nitrosamines in samples

2.7 實際樣品的檢測結(jié)果

應(yīng)用本方法對購自本地超市的3種即食魚制品進(jìn)行檢測，除NPYR未檢出外，其他N-亞硝胺均被不同程度檢出，其中NDMA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.21～8.84 μg/kg，與文獻(xiàn)[4]報道類似，其他N-亞硝胺含量介于LOD和LOQ之間。

3 結(jié) 論

本研究建立了氫氧化鋇處理-SADLLME結(jié)合GC-MS/MS檢測即食魚制品中7種N-亞硝胺的新方法。該方法具有樣品前處理簡單，成本低廉，靈敏、可靠的優(yōu)點，能夠滿足相關(guān)食品中N-亞硝胺檢測的需要，以期為相關(guān)食品的安全監(jiān)測提供方法和借鑒。