李 娟，鄧澤元，范亞葦

（南昌大學 南昌330047）

蕎麥蜂花粉是蜜蜂從蕎麥花藥中采集花粉，經儲存和發(fā)酵形成的花粉團，含有豐富的營養(yǎng)物質和活性成分，被稱為“微型營養(yǎng)庫”，多糖是其重要的組成部分之一。天然來源的多糖作為一種重要的生物活性物質，具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、調節(jié)胃腸等多種作用[1-2]。近年來，已有對蕎麥蜂花粉多糖的抗氧化，提高免疫，降血脂等活性功能的研究[3-4]，而未見對蕎麥蜂花粉多糖的體外發(fā)酵行為及對腸道菌群的影響報道。腸道菌群是定值在人體胃、腸道微生物的總稱，約有1 000 多種，數量達1013～1014，是人體體細胞數量的10 多倍[5]。最近研究表明，腸道菌群不僅具有調節(jié)腸道功能、促進消化吸收、提高免疫力等被人熟知的作用，還具有調節(jié)腦-腸影響宿主的腦功能和行為能力等作用[6-8]。由于人體缺乏碳水化合物活性酶，大多數非消化性多糖不能被人體消化吸收，因此主要通過腸道微生物群落發(fā)酵來發(fā)揮生理活性作用[9]。人體新鮮糞便中的菌群種類及組成與人體腸道內的菌群較為相似，可通過研究多糖在糞便菌群的發(fā)酵行為來表征腸道菌群。目前對于多糖對腸道菌群作用的研究多采用體外發(fā)酵模型和動物實驗，相比動物實驗，體外發(fā)酵試驗更為經濟且易控制試驗參數，并可多次重復試驗，是研究不同化合物與腸道菌群相互作用的重要工具[10]。

多糖的對人體腸道菌群的作用與其酵解后產生的代謝產物密切相關，尤其是酵解過程中短鏈脂肪酸的組成情況[11]。多糖在腸道內被菌群酵解產生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸（SCFAs）可作為腸道上皮細胞的能量來源，保護腸道黏膜[12]，具有調節(jié)腸道菌群、抗炎、抗腫瘤、調節(jié)免疫應答等功能[13]。同時短鏈脂肪酸的生成會降低環(huán)境中pH 值，形成酸性環(huán)境，維持電解質平衡，促進有益菌的生長[14]。通過分析多糖酵解過程的代謝行為及代謝產物，可反映多糖對腸道菌群的影響。本研究通過建立體外發(fā)酵模型，分析不同濃度蕎麥蜂花粉多糖對人體糞便微生物菌群代謝產物的影響，探究蕎麥蜂花粉多糖的益生元作用，為今后蕎麥蜂花粉多糖與腸道菌群的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥蜂花粉，購自山西蜂農；苯酚、水楊酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉，大茂化工試劑廠；次氯酸鈉，天津市永大化學試劑有限公司；偏磷酸，上海振興化工一廠；菊糖（分析純級）、短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸）系列標準品，上海阿拉丁試劑有限公司。發(fā)酵培養(yǎng)液中各試劑均為分析純級。

1.2 主要儀器與設備

Bio-Tek 酶標儀，美國伯騰有限公司；Agilent68990N 氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蕎麥蜂花粉多糖的制備 稱取適量破碎完全的蕎麥蜂花粉，置于50℃、90%乙醇溶液中回流脫脂1 h，自然晾干后于90℃去離子水中浸提4 h，離心取上清液，減壓濃縮后加入4 倍體積無水乙醇醇沉。采用木瓜蛋白酶-Sevag 法除蛋白，透析、冷凍干燥即得蕎麥蜂花粉多糖，命名為WFPP。采用苯酚-硫酸法測定中性糖含量，間羥基聯苯法測定糖醛酸含量，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.3.2 多糖單糖組成分析 參照文獻[15]方法測定蕎麥蜂花粉多糖單糖組成，WFPP 經三氟乙酸溶液水解為多糖，之后對水解產物進行糖精乙酸酯衍生處理，衍生物用氣相色譜分析。

1.3.3 多糖體外發(fā)酵

1.3.3.1 培養(yǎng)基配制 按文獻[16]方法分別配制微量培養(yǎng)液和衡量緩沖液，2 種溶液按體積比1∶100 的比例混合，即發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.3.3.2 體外酵解收集3 名志愿者的新鮮糞便（志愿者無胃、腸道疾病且至少3 個月內未服用抗生素），分別從志愿者糞便中取等量糞便混合，按固液比1∶5 加入發(fā)酵培養(yǎng)液，均質化后用4 層無菌紗布過濾，收集濾液即人體糞便接種物，備用。

將蕎麥蜂花粉多糖及菊糖按一定比例分別加入發(fā)酵培養(yǎng)液中進行體外發(fā)酵。對于測試的樣品，最終的酵解體系組成為50%酵解培養(yǎng)基，50%人體糞便液，將發(fā)酵液轉移至厭氧密封管中，在厭氧體系中（80%N2、10%CO2、10%H2）37℃酵解培養(yǎng)48 h。試驗分為5 組，以不添加多糖為空白對照組（CK 組），以菊糖為陽性對照組（菊糖組），培養(yǎng)液中菊糖含量為2.5%；多糖組分為低、中、高3 個水平（WFPP-L 組、WFPP-M 組、WFPP-H 組），各組培養(yǎng)液中糖含量分別為2.5%，5%，10%。

1.3.4 發(fā)酵液中pH 值的測定 在酵解0，6，12，18，24，36，48 h 時收集樣品發(fā)酵產物，迅速浸入冰水中停止發(fā)酵。離心后取上清液即發(fā)酵液，用精密pH 儀測定其pH 值。

1.3.5 總糖消耗率的計算取1.3.4 節(jié)收集的發(fā)酵液，采用苯酚-硫酸法[17]測定其總糖含量，計算發(fā)酵過程中多糖消耗率。

1.3.6 發(fā)酵液中NH3-N 含量的測定 發(fā)酵液中NH3-N 含量計算參照胡偉蓮[18]的方法，采用水楊酸-次氯酸鈉比色法測定發(fā)酵產物中NH3-N 含量。稱取適量氯化銨溶于鹽酸，配制系列濃度的氨氮標準溶液，樣品處理后于波長700 nm 處測定吸光值，根據標準曲線計算發(fā)酵液中NH3-N 含量。

1.3.7 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量的測定 采用氣相色譜法[19]測定發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的含量。取離心后的發(fā)酵液，按體積比4∶1 加入25%偏磷酸，渦旋混勻后離心，取上清液，待測。

色譜條件：Agilent68990N 氣相色譜儀，FFAP柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），FID 檢測器。升溫程序：設置初始柱溫100℃，保持1 min，然后以4℃/min 升至180℃，之后以20℃/min 升至200℃，維持5 min。設置檢測器和進樣口溫度分別為240℃和200℃，載氣、燃氣分別為N2、H2。N2、H2及空氣流速分別為2，30，300 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。通過樣品峰面積與標準品對比來計算脂肪酸含量。

2 結果與分析

2.1 多糖的單糖組成

蕎麥蜂花粉經脫脂、水提醇沉、除蛋白、透析、凍干等處理，得到其多糖WFPP，得率為4.31%。測得其中性糖含量為59.48%、糖醛酸含量11.0%，蛋白含量1.31%，水分含量9.15%。

WFPP 單糖氣相色譜圖及各單糖組成情況見圖1和表1。WFPP 主要由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal 等單糖組成，它們物質的量比為2.84∶34.57∶1.69∶1.12∶27.11∶30.84。WFPP 主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖單糖組成，3 種單糖總含量達92.52%，含有少量的鼠李糖、木糖、甘露糖。其中阿拉伯糖與半乳糖的比例約為1∶1，推測WFPP由阿拉伯半乳聚糖。碘-碘化鉀試驗為陰性，提取的多糖中無淀粉組分，同時WFPP 中葡萄糖含量較高，表明WFPP 中含有葡聚糖。由此可推測WFPP 主要由阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖組成，這與從大利[20]的研究結果一致。

圖1 WFPP 單糖氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of WFPP monosaccharides

表1 WFPP 單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of WFPP

2.2 發(fā)酵液pH 值的變化

pH 值是反映多糖在酵解過程中被人體腸道菌群利用程度的重要指標[21]。如圖2所示，除空白組外，其它4 組發(fā)酵液pH 值隨發(fā)酵時間的延長而降低，pH 值變化主要發(fā)生在發(fā)酵前18 h 內。酵解48 h 后，CK 組的pH 值從最初的7.49 降到7.33，無明顯變化；菊糖組pH 值降至6.12；WFPPL、WFPP-M 和WFPP-H 組pH 值分別降低至5.73，5.3，4.64，相較CK 組和菊糖組，發(fā)酵前、后多糖組pH 值顯著降低。整個發(fā)酵過程中，蕎麥蜂花粉多糖培養(yǎng)物中的pH 值始終低于空白組及陽性對照組，發(fā)酵18 h 時WFPP-H 組發(fā)酵液pH 值已降至4.54，且WFPP 添加量越大，發(fā)酵液pH 值降幅越明顯。陳春[22]發(fā)現桑葚多糖在體外酵解過程中隨著酵解時間的延長培養(yǎng)物中pH 值降低，與本研究結果一致。酵解過程中多糖被腸道中雙歧桿菌等菌群利用產生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，降低培養(yǎng)液pH 值，同時環(huán)境中pH 值的變化也影響短鏈脂肪酸的生成和腸道微生物組成[23]。腸道pH 值的降低會使腸道形成一個酸性環(huán)境，抑制有害菌的繁殖，促進有益菌的生長。另一方面pH 值也影響腸道微生物的酶活性，對人體腸道健康具有積極作用。

圖2 體外發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化Fig.2 The change of pH values of fermentation broth during in vitro fermentation

2.3 發(fā)酵液中總糖消耗率的變化

整個發(fā)酵過程中，各組發(fā)酵液中總糖含量均不同程度降低。尤其在發(fā)酵0～18 h 期間，總糖含量下降趨勢最為明顯。相較菊糖組，WFPP 主要在0～6 h 被消耗，發(fā)酵6 h 后WFPP 組總糖消耗率達50%，發(fā)酵18 h 后，WFPP-L、WFPP-M 及WFPPH 各組糖質量濃度分別為0.29，0.41，0.56 mg/mL，此時發(fā)酵液中糖含量較低，與空白組0.27 mg/mL相似，WFPP 基本被腸道菌群消耗。菊糖主要在6～12 h 被微生物降解利用，發(fā)酵6 h 后菊糖中總糖消耗量僅增加14.22%，酵解12 h 后，消耗率為69.18%。發(fā)酵24 h，發(fā)酵液中WFPP 基本被消耗，在發(fā)酵24～48 h 期間糖含量無顯著變化，表明人體糞便腸道菌群主要在發(fā)酵前期酵解蕎麥蜂花粉多糖，在培養(yǎng)液中添加不同劑量的蕎麥蜂花粉多糖，均能被菌群較好的消化利用。

不同碳水化合物的降解程度及被腸道菌群的消耗速率存在差異，原因可能與多糖的組成及理化性質有關，如單糖組成、聚合度、側鏈分布及空間構像等，多糖的溶解度、黏度也會影響多糖被糞便菌群酵解的效果[24]。有文獻報道，某些膳食纖維、菊糖在體外發(fā)酵24 h 后，90%以上能被糞便菌群消耗掉，而麥芽糊在酵解過程中利用率低于50%[25]。車前子多糖在酵解24 h 后碳水化合物消耗量為47.2%，相同發(fā)酵時間內豌豆纖維僅有20%被腸道菌群酵解利用[26]。

2.4 發(fā)酵液中NH3-N 含量

如圖4所示，發(fā)酵0～12 h，CK 組、菊糖組及WFPP-L 組培養(yǎng)液中NH3-N 含量隨著時間的延長而持續(xù)增加，而WFPP-M 及WFPP-H 兩組NH3-N 的含量逐漸降低。發(fā)酵12 h 時，WFPP-H組發(fā)酵液中NH3-N 含量達到最低值17.75 mg/mL。發(fā)酵12～48 h，各組發(fā)酵液中NH3-N 含量均上升，WFPP-H 組NH3-N 含量增幅及質量濃度均明顯低于其它4 組，其次是WFPP-M 組。發(fā)酵0～48 h，空白組發(fā)酵液中NH3-N 含量逐漸增加，且始終高于其它4 組。添加蕎麥蜂花粉多糖能降低培養(yǎng)液中NH3-N 含量，添加量越高效果越明顯，高劑量多糖在發(fā)酵12 h 時能顯著抑制菌群產生NH3-N。

氨態(tài)氮是酵解過程中外源蛋白質和內源含氮物質降解的重要產物。一般情況下，NH3-N 含量處于動態(tài)平衡，受環(huán)境中蛋白降解度、微生物的合成速度及NH3-N 吸收利用等因素的影響。環(huán)境中NH3-N 含量過高，易引起氨中毒[18]。發(fā)酵0～12 h，糞便菌群主要酵解多糖生成短鏈脂肪酸，形成酸性環(huán)境，有利于腸道有益微生物的生長，提高對氨的利用。隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)物中多糖逐漸被消耗，在此過程中主要進行蛋白發(fā)酵，產生氨、胺及吲哚等物質，培養(yǎng)液中NH3-N 逐漸積累[27]。

圖3 不同發(fā)酵時間點發(fā)酵液中糖含量Fig.3 Total carbohydrate at different time points during fermentation

圖4 不同發(fā)酵時間的培養(yǎng)液中NH3-N 含量Fig.4 The content of NH3-N in culture medium of different fermentation time

2.5 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量的變化

乙酸、丙酸、正丁酸是體外發(fā)酵形成的主要短鏈脂肪酸，是多糖體外酵解的典型代謝產物。除這3 種主要SCFAs 外，在發(fā)酵過程中還產生少量的異丁酸、正戊酸、異戊酸，是由蛋白質發(fā)酵產生。整個發(fā)酵過程中，WFPP 組酵解培養(yǎng)物中的SCFAs含量始終高于CK 組。除CK 組外，各組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、正丁酸及正戊酸的含量整體上是增加的，異丁酸、異戊酸含量無明顯變化，且與CK 組沒有顯著差異。發(fā)酵0～24 h，各組發(fā)酵液中乙酸含量顯著升高，WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L 及菊糖組分別從最初的4.89，4.25，4.12，3.63 mmol/L增至46.17，23.91，12.44，6.56 mmol/L；各組中丙酸含量從最初1～2 mmol/L 升至17.86，10.76，6.03，1.66，1.36 mmol/L。WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L及菊糖組的正丁酸從最初0.94，0.87，1.13，0.71 mmol/L 升至12.24，4.50，2.08，0.71 mmol/L。發(fā)酵24～48 h，各組代謝產物中乙酸、丙酸、丁酸含量無明顯變化，發(fā)酵36～48 h，其含量出現小幅下降，可能是隨著發(fā)酵時間的延長培養(yǎng)基中菌群大量繁殖，酵解產生的短鏈脂肪酸被菌群利用，短鏈脂肪酸逐漸被消耗，因而其含量不再增加，甚至出現下降。

圖5 發(fā)酵過程中不同時間點發(fā)酵液SCFAs 濃度的變化Fig.5 Changes of SCFAs concentration at different time points in fermentation cultures

SCFAs 是胃、腸道中厭氧微生物發(fā)酵產生的最終代謝產物，易被人體吸收，被認為是宿主腸道的重要能量來源[28]。乙酸是擬桿菌門的主要代謝產物，能夠進入外周循環(huán)而被外周組織代謝；丙酸通常被肝臟代謝，可抑制膽固醇的合成，并作為結腸上皮細胞的能量來源，起到緩解慢性腸道炎癥的作用；丁酸是一種主要由厚壁菌門產生的有益代謝物，能抑制去乙?；富钚?，調節(jié)宿主基因表達，在緩解炎癥、減少結腸癌等方面發(fā)揮著重要的作用[29]。SCFAs 通過調節(jié)宿主代謝組織中SCFAs受體和靶分子表達參與宿主生理反應，乙酸、丙酸、丁酸均可結合并激活免疫細胞主要受體GPR41、GPR43，丁酸及β-羥基丁酸對GPR109 也有激活作用[30]。Wang 等[31]發(fā)現嗜酸乳桿菌可增加β-乳球蛋白致敏小鼠糞便短鏈脂肪酸濃度，通過誘導致敏小鼠脾臟和結腸中SCFAs 受體GPR41、GPR43 的表達，減輕小鼠過敏性炎癥反應。Furusawa 等[32]提出短鏈脂肪酸可通過抑制調控基因表達蛋白HDACs 活性，促進Foxp3 表達，從而調控Tregs 的分化與功能，影響機體免疫相關性疾病的進展。

3 結論

通過分析不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中pH 值、總糖、NH3-N 及短鏈脂肪酸含量變化，探究蕎麥蜂花粉多糖在人體糞便中的發(fā)酵規(guī)律，揭示不同劑量蕎麥蜂花粉多糖對人體糞便菌群的影響。結果顯示：隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中pH 值逐漸降低，WFPP 的添加量越高，pH 值下降明顯。蕎麥蜂花粉多糖主要在發(fā)酵前24 h 被糞便菌群酵解利用，體外發(fā)酵24 h 后，發(fā)酵液中WFPP 消耗量均在80%以上；酵解12 h 后，添加中、高劑量的WFPP 可明顯降低培養(yǎng)液中的NH3-N 含量。除此之外，乙酸、丙酸、正丁酸是糞便腸道菌群酵解蕎麥蜂花粉多糖生成的主要短鏈脂肪酸，其主要在發(fā)酵0～24 h 產生，這與多糖在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律一致，且WFPP 添加量越高，酵解產生的短鏈脂肪酸越多。綜上所述，蕎麥蜂花粉多糖在腸道中可被人糞便菌群酵解利用，產生的SCFAs 等代謝產物對腸道菌群有積極作用，有利于人體健康。