趙東陽，石 潔，蘇茹月，鄭丹薇，朱巖昆，馬曉光，王少華，李 輝，孫國清，孫定勇

河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作為一種前沿抗結(jié)核藥物在結(jié)核病一線和二線治療方案中均發(fā)揮重要作用[1]。該藥物能有效對抗體內(nèi)巨噬細胞中滯留的不能被其他的抗結(jié)核藥物所殺死的結(jié)核分枝桿菌。PZA需要在吡嗪酰胺酶(PZase)的作用下轉(zhuǎn)化為有活性的吡嗪酸發(fā)揮作用。PZase是由561個核苷酸編碼的蛋白。pncA基因突變導(dǎo)致PZase失活，是引起結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的主要機制。pncA突變具有高度可變性，且散在分布于開放閱讀框及上游基因調(diào)控區(qū)域[2]。除了pncA基因突變外，編碼30S核糖體蛋白S1的基因rpsA突變后，會改變吡嗪酸的結(jié)合位點，也可引起PZA耐藥[3]。有研究[4]表明panD和結(jié)核分枝桿菌PZA的耐藥相關(guān)。到目前為止，rpsA和panD突變是否引起結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥仍有爭議性，因此需要更多實驗數(shù)據(jù)來闡明兩者與PZA耐藥的關(guān)系。

由于PZA只有在低pH值條件下才具有抗菌活性，因此在做PZA藥敏測定時需在酸性環(huán)境下進行。且PZA藥敏測定操作較復(fù)雜，實驗失敗可能性較大，同時結(jié)核分枝桿菌生長周期長，常規(guī)PZA藥敏檢測需要2～3周，因此近年來分子診斷成為檢測PZA耐藥的一種重要工具。本研究對152株耐多藥(MDR)結(jié)核分枝桿菌菌株進行了PZA藥敏測定，同時對pncA、rpsA和panD突變預(yù)測PZA耐藥性的效能進行了評價。

1 材料與方法

1.1樣本來源收集2018年1月至12月于新密市、嵩縣、扶溝縣、焦作市疾病預(yù)防控制中心，中牟縣衛(wèi)生防疫站，鄧州市、南陽市、開封市、安陽市結(jié)核病防治所，鶴壁市傳染病醫(yī)院就診的152例MDR肺結(jié)核病患者的痰標本，進行痰培養(yǎng)。同時對患者進行問卷調(diào)查，將菌株標本和調(diào)查問卷集中送至河南省疾病預(yù)防控制中心進行后續(xù)研究。該項目由河南省疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。從病歷記錄中獲取信息。就診前接受過不規(guī)則化療超過1個月的結(jié)核病患者被定義為復(fù)治患者。

1.2pncA、rpsA和panD基因突變檢測從培養(yǎng)陽性的羅氏培養(yǎng)基上刮取新鮮的培養(yǎng)菌至500 μL TE緩存液中，85 ℃滅活30 min，煮沸5 min后離心待用[5]。取2 μL DNA加入含有引物的PCR預(yù)混液(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，使用粗提的DNA為模板進行擴增，pncA上游引物5’-AA CAGTTCATCCCGGTTC-3’，下游引物5’-GCGTCAT GGACCCTATATC-3’；rpsA上游引物5’-CGGAG CAACCCAACAATA-3’，下游引物5’-GTGGACAG CAACGACTTC-3’；panD上游引物5’-TCAACGGT TCCGGTCGGCTGCT-3’，下游引物5’-TATCCGC CACTGCTGCACGACCTT-3’。 擴增體系20 μL，PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，并與野生型菌株H37Rv序列比較。

1.3Spoligotyping和NTF分析按照文獻[5]進行Spoligotyping分析。應(yīng)用DR區(qū)上游引物5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’和下游引物5’ -GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’對抽提的基因組進行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物與預(yù)先包被43條間隔寡核苷酸的膜雜交，根據(jù)43個不同間隔區(qū)存在情況判讀結(jié)果。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌NTF區(qū)設(shè)計上游引物5’-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3’，下游引物5’-TGCCGTTCTCGAAATCTAAACAA-3’[6]；若NTF區(qū)域存在IS6110片段插入為現(xiàn)代型，否則為古典型。

1.4PZA藥敏及最小抑菌濃度(MIC)測定使用購自美國BD公司的結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)基(Bactec MIGT 960)培養(yǎng)細菌，加入終濃度為100 mg/L的PZA，7～10 d后讀取結(jié)果，報告陽性的為耐藥菌，陰性的為敏感菌[7]。使用微孔板法進行MIC檢測。在96孔板第1列加入含有PZA濃度400 mg/L的pH5.5的7H9液體培養(yǎng)基，倍比稀釋，直至倒數(shù)第2列PZA濃度為3.13 mg/L。將1個麥氏濃度的結(jié)核分枝桿菌稀釋100倍后，每孔加入100 μL。37 ℃培養(yǎng)7 d，每孔加入3 μL 體積分數(shù)為1%的刃天青和12 μL 體積分數(shù)為5% 的Tween-80，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。以藍色孔為無菌生長，粉色孔為有菌生長，藍色孔對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。

1.5數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0進行比值比和95%CI的分析來判斷不同組別間PZA耐藥性是否存在差異。根據(jù)標準差計算公式使用MedCalc在線計算工具(https://www.MedCalc.net/)計算靈敏度和特異度的95%CI。

2 結(jié)果

2.1不同特征的MDR結(jié)核患者PZA耐藥分析見表1。152株MDR結(jié)核分枝桿菌菌株中有105株P(guān)ZA耐藥，耐藥率為69.1%。比較不同特征MDR 結(jié)核患者PZA的耐藥性發(fā)現(xiàn)北京家族更易產(chǎn)生PZA耐藥，且現(xiàn)代型菌株對PZA具有更高的耐藥頻率。

表1 不同特征的MDR結(jié)核患者PZA的耐藥性分析

2.2pncA、rpsA和panD基因突變情況152株MDR結(jié)核分歧桿菌菌株中有102株發(fā)生pncA基因突變，突變率為67.1%(102/152)，其中3個為同義突變；82株發(fā)生堿基突變(包含3個同義突變)，20株菌發(fā)生移碼突變，有9種突變?yōu)榘l(fā)生在多個菌株的共享突變。有133株P(guān)ZA藥敏結(jié)果和pncA測序結(jié)果一致；有8個PZA敏感菌株的pncA基因發(fā)生了堿基突變，其中3個是同義突變；11株P(guān)ZA耐藥菌株的pncA基因未發(fā)生突變。對發(fā)生了pncA基因突變的8株P(guān)ZA敏感菌菌株進行MIC測定，結(jié)果見表2。

表2 pncA突變的8株P(guān)ZA敏感菌的MIC

rpsA和panD基因突變情況見表3。rpsA和panD的啟動子區(qū)均未發(fā)現(xiàn)突變位點，并且大多數(shù)rpsA和panD發(fā)生突變的PZA耐藥菌株均同時伴隨著pncA的突變。152株MDR結(jié)核分枝桿菌菌株中有76株發(fā)生rpsA基因突變，突變率為72.4%。rpsA的突變散在分布，但主要集中在N末端。在rpsA基因357位和532位核苷酸突變的PZA耐藥菌株中未檢測到pncA突變；rpsA基因636位核苷酸的同義突變?yōu)榉翘禺愋酝蛔?，?8株P(guān)ZA耐藥菌株和35株P(guān)ZA敏感菌株中均發(fā)生了該突變。在47株P(guān)ZA敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)panD基因突變。在105株P(guān)ZA耐藥菌株中有2株菌發(fā)生panD基因突變，其中1株未檢測到pncA的突變。

表3 rpsA和panD基因突變情況

以PZA的藥敏表型為參照，使用pncA突變檢測PZA耐藥的靈敏度為89.52%(95%CI為81.64%～94.39%)，特異度為89.36% (95%CI為76.10%～96.01%)，見表4。rpsA/panD突變與PZA的耐藥表型的一致性較差，但rpsA和panD突變與pncA聯(lián)合后，可將僅用pncA檢測PZA耐藥的靈敏度提高。

表4 MDR結(jié)核分枝桿菌菌株P(guān)ZA耐藥性的效能評價

3 討論

PZA在MDR結(jié)核患者治療中發(fā)揮了重要作用[8]。本研究調(diào)查了河南MDR結(jié)核患者的PZA耐藥情況，結(jié)果顯示69.1%的MDR結(jié)核分枝桿菌菌株對PZA耐藥,與重慶地區(qū)的耐藥率(62.4%)相近[9]，略高于之前的研究結(jié)果[10-13]。

有研究[14]認為結(jié)核桿菌的基因譜系與PZA的耐藥性不存在相關(guān)性。本研究結(jié)果表明北京型結(jié)核分枝桿菌的PZA耐藥比例明顯高于非北京型，且現(xiàn)代型高于古典型。但由于樣本量的欠缺，尚不能認為PZA的耐藥性和結(jié)核桿菌基因型相關(guān)。

不同地區(qū)PZA耐藥菌株中pncA基因發(fā)生突變的比率有所不同，巴西為45.7%[15]，伊朗為70.6%[16]，臺灣為75.0%[17]，重慶為88%[9]，瑞典為94.1%[18]。本研究pncA基因突變發(fā)生率為67.1%(102/152)。雖然之前文獻[2,19-20]報道pncA基因突變與菌株成簇情況有一定關(guān)聯(lián)，由于本研究中納入菌株較少且主要為北京家族基因型，不能判斷這些菌株是否具有成簇性。

與之前的研究[7，12]比較，本研究中的MDR結(jié)核分期桿菌菌株rpsA突變頻率較高，有72.4%(76/105)PZA耐藥的菌株發(fā)生rpsA的突變。636位核苷酸在PZA耐藥和敏感菌株中均有較高比例的同義突變。但在PZA的敏感株中未發(fā)現(xiàn)rpsA的錯義或移碼突變。本研究發(fā)現(xiàn)rpsA基因的突變主要集中于C末端，與之前研究[7,10]相一致。此外rpsA的突變位點中有5個為首次報道，這些rpsA的突變位點對PZA耐藥性的影響還需進一步驗證。本研究結(jié)果表明PZA耐藥菌株中有2株發(fā)生panD基因突變，有1株為pncA野生型耐藥菌株。

本研究PZA的耐藥表型和pncA突變序列相一致的有89.52%。8株菌的pncA基因發(fā)生突變但其藥敏結(jié)果顯示對PZA敏感(其中3株為同義突變)，有8株pncA野生型分離株卻表現(xiàn)出PZA耐藥。作者對pncA發(fā)生突變的PZA敏感株進行了MIC測定，除了3株發(fā)生同義突變的菌株，其余5株pncA發(fā)生突變菌株均表現(xiàn)為PZA低水平耐藥(12.5 mg/L

本研究聯(lián)合使用3種基因測序結(jié)果評估PZA耐藥性的靈敏度和特異度分別為92.38%和89.36%，與其他研究相一致[23]。

納入的樣本量較少是本研究主要限制，并且所有的菌株均來自同一地區(qū)也降低了結(jié)果的代表性，日后將收集更多樣本進行研究。

綜上所述，通過對河南省MDR結(jié)核患者的pncA、rpsA和panD基因突變情況進行檢測和分析，可快速、準確地預(yù)測PZA耐藥性。