劉素娜，郝長付，暴 磊，趙德華，王麗雯，姚 武

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院新生兒疾病篩查科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001 3)河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 石家莊 050017

矽肺是由于長期低濃度吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的以肺間質(zhì)炎癥和彌漫性纖維化為主的全身性疾病[1]。目前矽肺的發(fā)病機制尚不完全清楚，沒有早期診斷的特異性生物標(biāo)志物，也沒有逆轉(zhuǎn)肺纖維化的治療藥物和方法，因而矽肺仍未得到有效控制，其防控形勢依然嚴(yán)峻[2]。有研究[3]證實，矽肺纖維化過程中有許多生長因子、炎癥細(xì)胞因子等蛋白質(zhì)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的參與。SiO2暴露會引起機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化，也必然會引起肺組織中多種蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)表達(dá)水平的改變，這是矽肺肺組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理論基礎(chǔ)。以往對蛋白質(zhì)的研究檢測方法有Western blot、免疫組化、ELISA等，常常只能知道一種或幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，而應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)則可以得到兩種樣品中所有蛋白質(zhì)表達(dá)情況的差別，可以整體、綜合、全面地反映在特定情形、特定時段樣品蛋白質(zhì)組的情況。

課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，在3周內(nèi)細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成的炎性反應(yīng)期，大鼠肺組織中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-18表達(dá)均顯著增高。本研究擬采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)中經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)，再聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，篩選SiO2暴露3周大鼠矽肺早期炎癥反應(yīng)期肺組織中的差異蛋白，建立矽肺差異蛋白圖譜，并利用Western blot技術(shù)挑選差異蛋白進(jìn)行鑒定，為尋找早期矽肺炎癥可能的干預(yù)生物標(biāo)志物、探索矽肺發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF 級 SD 大鼠20只，雄性，180～220 g，6～8 周齡，購自河南省實驗動物中心[許可證號SCXK(豫)2010-0002]。采用隨機數(shù)字表法將20只大鼠隨機分為對照組和模型組(每組10只)。

1.2主要實驗試劑與儀器游離SiO2標(biāo)準(zhǔn)品(粒徑在1～5 μm的>80%)購自美國Sigma公司，24 cm pH 3～10線形IPG膠條、Bio-lyte3/10兩性電解質(zhì)均購自GE Healthcare公司，抗組蛋白H2B1型(H2B1)抗體、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)抗體和GAPDH 抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，RIPA組織蛋白裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、SDS-PAGE配制試劑盒購自武漢碧云天生物技術(shù)研究所，DYY-6C型垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳儀購自Amersham Biosciences公司，5800 MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀購自美國AB公司，凝膠圖像掃描儀、Image Master 2D Platinum 6.0購自GE Healthcare公司，Centrifuge 5424 R離心機購自Eppendorf公司。

1.3大鼠矽肺模型的建立采用吸入式氣管滴注法建立大鼠矽肺模型[5-6]。將游離SiO2標(biāo)準(zhǔn)品研磨，180 ℃干燥4 h，恒重，用滅菌生理鹽水配成100 g/L的SiO2懸液。高壓蒸汽滅菌后4 ℃冰箱保存，染塵前加2 000 U/mL青霉素。采用異氟烷大鼠自主吸入麻醉法麻醉大鼠，之后大鼠牙齒勾住細(xì)繩懸掛于造模染塵架上，用強光手電筒照射頸部氣管，從空腔看到一張一合的氣管口時用中號無頭圓鈍灌胃針進(jìn)行氣管內(nèi)插管。插管成功后快速將1 mL的SiO2懸液推入氣管，再向氣管內(nèi)推入2 mL空氣，迅速拔管，以盡快解除窒息。對照組以含等量青霉素的無菌生理鹽水1 mL代替SiO2懸液，以同樣方法向大鼠氣管內(nèi)滴注。1次/d，共染塵3次。于染塵 3 周后處死大鼠。

1.4肺組織HE染色處死大鼠后，取左肺中部約1 cm×1 cm大小的肺組織塊，生理鹽水沖洗2遍后立即置于體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛中固定；經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行切片(片厚3 μm)、HE染色，剩余肺組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5肺組織蛋白的提取取肺組織100 mg，用眼科剪剪碎后放進(jìn)研磨勻漿器中，加1 mL蛋白裂解液置冰上研磨，使蛋白充分裂解；將組織勻漿液轉(zhuǎn)移入新的EP管中，冰浴超聲(400 W，工作時間10 s；間隔10 s，共20次)進(jìn)一步破碎組織細(xì)胞，然后4 ℃離心，12 000×g，30 min；吸取上清，4 ℃離心，12 000×g，20 min；吸取上清，4 ℃離心，12 000×g，10 min，取上清液，用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6雙向電泳將同組大鼠的蛋白質(zhì)樣品等量混勻，取700 μg，加水化上樣緩沖液使總體積至450 μL，加入2.5 μg Bio-lyte3/10兩性電解質(zhì)和4 mg DTT混勻，置IPGphor等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序：30 V，12 h；100 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000 V，55 000 Vh；500 V，5 h。等電聚焦工作溫度為20 ℃，每根膠條電流50 μA。等電聚焦結(jié)束取出膠條平衡后，移至120 g/L分離膠中進(jìn)行垂直電泳。每組3次。

1.7二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)凝膠圖像掃描與質(zhì)譜分析雙向電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對凝膠進(jìn)行染色，然后用凝膠圖像掃描儀采用800 ppi分辨率對染色后的凝膠進(jìn)行掃描，應(yīng)用Image Master 2D Platinum 6.0對雙向電泳圖譜進(jìn)行分析。標(biāo)記、挖取差異蛋白點，送生工生物工程(上海)股份有限公司，采用5800 MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到每個樣品各個肽段的質(zhì)荷比(M/Z)測定數(shù)據(jù)，使用Mascot軟件，在NCBInr數(shù)據(jù)庫中搜索理論上能與肽段相匹配的蛋白。綜合分析蛋白數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果、相對分子質(zhì)量、實際等電點(actual isoelectric point，PI)和得分等因素，對蛋白進(jìn)行最終鑒定。

1.8肺組織中差異蛋白的Westernblot分析本實驗參考文獻(xiàn)[7]，應(yīng)用Western blot檢測篩選的評分最高和評分最低的差異蛋白在大鼠肺組織中的表達(dá)情況。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度后，調(diào)節(jié)蛋白濃度，用100 g/L SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜。50 g/L脫脂奶粉液室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗3遍，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較對照組和模型組大鼠肺組織中CRT和H2B1蛋白表達(dá)的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠矽肺模型的鑒定染塵3周后，肉眼觀察對照組大鼠肺組織粉紅色，質(zhì)軟，表面光滑；模型組大鼠雙肺體積增大，局部充血、腫脹，表面均勻分布直徑1 mm 左右的灰白色小結(jié)節(jié)，灰白色結(jié)節(jié)不規(guī)則狀突出于肺表面(圖1)。HE染色顯示對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠肺組織出現(xiàn)典型的細(xì)胞性結(jié)節(jié)改變，矽結(jié)節(jié)數(shù)量增多且體積增大，肺組織結(jié)構(gòu)有破壞(圖2)。

圖1 2組大鼠肺組織標(biāo)本肉眼觀

黑色箭頭指示細(xì)胞性結(jié)節(jié)

2.2雙向電泳與圖像分析結(jié)果雙向電泳圖譜見圖3。分別對染色后的蛋白點進(jìn)行匹配，染色匹配率為77%，效果均較好。

圖3 2組大鼠肺組織總蛋白雙向電泳圖譜

2.3差異蛋白點MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定與分析結(jié)果對雙向電泳圖譜進(jìn)行分析，共獲得274組蛋白點信息，經(jīng)過綜合對比分析，篩選出15個差異蛋白點。采用一級和二級質(zhì)譜相結(jié)合的方法對15個差異蛋白點進(jìn)行鑒定，14個蛋白點獲得14張良好的肽質(zhì)量指紋圖譜，碰撞碎裂后的母離子肽段均獲得了較為豐富的碎片信息，指紋圖譜峰信號強，質(zhì)量高。第10號蛋白肽指紋圖譜片段峰主要位于1 000～2 500 M/Z區(qū)間(圖4)。經(jīng)與NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫查詢比對，其中6個差異蛋白點在數(shù)據(jù)庫中匹配到有意義的蛋白，這6種蛋白分別為原肌球蛋白2(tropomyosin-2，TMP2)、CRT、碳酸酐酶3(carbonic anhydrase 3，CAH3)、H2B1、肌酸激酶M(creatine kinase M chain，CRM)、肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(myosin regulatory light chain 2，MLC2)，其中TPM2、CRT和CAH3在矽肺大鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)；H2B1、CRM和MLC2表達(dá)上調(diào)。結(jié)果見表1。

圖4 2組大鼠肺組織雙向電泳圖譜中10號蛋白肽指紋圖譜

表1 差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

2.4Westernblot蛋白分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，與對照組相比，差異蛋白評分最高的CRT在大鼠矽肺模型表達(dá)降低(t=5.132，P<0.001)，評分最低的H2B1表達(dá)增高(t=2.145，P=0.017)。

圖5 2組大鼠肺組織中CRT和H2B1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

本研究采用吸入式氣管滴注法成功建立大鼠矽肺模型，HE染色結(jié)果顯示，染塵3周后模型組大鼠肺組織有較大的炎性結(jié)節(jié)形成。利用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，通過對2組大鼠肺組織蛋白點的對比分析，找出了15組差異蛋白。雙向電泳獲得了較為清晰的圖譜；每組進(jìn)行3次染色，匹配效果均較好。這些都說明本實驗有較好的重復(fù)性和可靠性。

TMP2屬于原肌球蛋白(tropomyosin,TM)的一個亞型，是廣泛分布于真核生物中的一種細(xì)胞骨架蛋白，哺乳動物中存在TM1、TM2、TM3和TM4 4個異構(gòu)體[8]。有研究[9]證實在大鼠肝纖維化模型組TMP2表達(dá)增強，提示其可能參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程。CRT是廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中的多功能調(diào)節(jié)蛋白，能夠維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，具有分子伴侶、細(xì)胞黏附和基因表達(dá)調(diào)控等多種生物學(xué)功能[10]。Lu等[11]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎臟CRT表達(dá)增加，其在糖尿病性腎病腎纖維化的發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示CRT在矽肺大鼠肺組織中表達(dá)降低，可能與矽肺前期炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子動態(tài)失衡有關(guān)。CAH3是一種細(xì)胞質(zhì)酶，參與了機體線粒體ATP的合成、自身免疫、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多項重要的生理過程[12]。Staunton等[13]研究發(fā)現(xiàn)CAH3水平隨肌肉老化逐漸增加，增高的CAH3水平提示人類在衰老的過程中肌纖維逐漸向慢性收縮性纖維轉(zhuǎn)化。H2B1是組蛋白H2B的一個亞型，對染色體的結(jié)構(gòu)有重要作用；H2B在損傷位點的單泛素化可能對DNA雙鏈的斷裂修復(fù)具有重要作用[14]。本課題組前期研究[15]通過建立矽肺纖維化體外細(xì)胞模型共篩選出1 815個基因存在組蛋白差異。該研究結(jié)果顯示H2B1在矽肺大鼠肺組織中表達(dá)增高。CRM是肌酸激酶的重要組成部分，對維持機體能量代謝平衡及機體運動過程起重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)血漿中高水平的CRM能夠反映急性心肌梗死預(yù)后[17]和作為肌萎縮性側(cè)索硬化癥早期出現(xiàn)的指標(biāo)[18]。Takamori等[19]研究發(fā)現(xiàn)肌酸激酶可以作為一種新穎的生物標(biāo)志來監(jiān)測某些腫瘤的預(yù)后。MLC2是肌球蛋白的主要調(diào)節(jié)區(qū)域，目前MLC2的進(jìn)化起源、表達(dá)模式和功能了解甚少，有研究[20]發(fā)現(xiàn)MLC2基因突變會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)缺陷和纖維化。

本課題組前期研究檢測了矽肺模型大鼠外周血和肺泡灌洗液中DC、Th1/Th2細(xì)胞和Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)情況[6,21]，結(jié)果顯示，矽肺大鼠肺臟中DC和Th1/Th2細(xì)胞均存在一個動態(tài)變化過程，3周是矽肺發(fā)展過程中Th1細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)期(1周、2周)向Th2細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)的纖維化期(6周、9周)的過渡時間。姚三巧等[22]研究發(fā)現(xiàn)早期煤工塵肺患者血清中表達(dá)特異性細(xì)胞因子?；诖耍緦嶒炦\用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定大鼠矽肺初期肺組織差異表達(dá)蛋白，對獲得的15個差異蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，最終鑒定出6個有意義的蛋白點，應(yīng)用Western blot檢測了CRT和H2B1蛋白在大鼠矽肺模型中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CRT 在大鼠矽肺模型中表達(dá)降低，H2B1表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，篩選的差異表達(dá)蛋白可能在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。