張 俊,馬 冰,劉彩林
1)駐馬店市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450000 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052
miRNA是一種單鏈RNA分子,在多種生物體中廣泛存在,其不僅參與調(diào)控細(xì)胞分化、衰老、免疫反應(yīng)等正常生理過程,還與人類疾病的發(fā)生關(guān)系密切[1]。炎癥與多種miRNA的異常表達(dá)有關(guān),這些miRNA通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)影響靶細(xì)胞炎癥因子的合成和分泌[2]。miR-140-5p是近些年來發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)作用的miRNA,在腫瘤、關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[3-4]。以前的研究[5]發(fā)現(xiàn),miR-140-5p在支氣管哮喘模型小鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一種常見的病原體,其可以誘導(dǎo)肺炎、毛細(xì)支氣管炎發(fā)生,RSV刺激可促使支氣管上皮細(xì)胞釋放大量炎癥因子,這也是RSV加重哮喘的重要原因[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞16-HBE,構(gòu)建支氣管上皮細(xì)胞炎癥模型,探討miR-140-5p在支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制。
1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器16-HBE購自上??道噬锟萍加邢薰尽SV病毒Long株購自美國ATCC。Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司,miR-140-5p陰性對照(miR-NC)及其mimic購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司,Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)過表達(dá)載體及其陰性對照載體由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司構(gòu)建。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR 試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司。IL-6、IL-8含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,IL-1β含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司,NO含量檢測試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)研究所,TNF-α含量檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。iNOS、TLR4抗體購自美國Abgent公司。酶標(biāo)儀和熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司;凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene公司;全自動(dòng)激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2miR-140-5p與TLR4靶向關(guān)系的預(yù)測和鑒定利用生物信息學(xué)軟件TargetScan分析miR-140-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-140-5p和TLR4的3’UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定二者的靶向關(guān)系。將含有野生型(WT)或突變型(MUT)TLR4 3’UTR結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-NC、miR-140-5p mimic共轉(zhuǎn)染到16-HBE細(xì)胞中,培養(yǎng)24 h以后,測定熒光素酶活性。
1.3上調(diào)miR-140-5p表達(dá)對炎癥模型16-HBE細(xì)胞炎癥因子分泌和NO合成的影響
1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將16-HBE細(xì)胞分成空白對照組、RSV組、miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組,RSV組、miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組細(xì)胞感染RSV(MOI=1)24 h,以制備炎癥模型。然后miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-140-5p mimic,按照Lipofectamine2000說明操作。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
1.3.2 Real-time PCR法檢測細(xì)胞中miR-140-5p的表達(dá) 分別收集4組細(xì)胞,每107個(gè)細(xì)胞內(nèi)添加1 mL Trizol試劑以提取細(xì)胞總RNA。RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定,OD(260 nm)/OD(280 nm)比值介于1.8~2.0,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取1 μg總RNA,添加1 μL的Oligo dT Primer,加RNase水補(bǔ)足12 μL,置于85 ℃結(jié)合5 min,冰上冷卻,然后添加1 μL的RNase抑制劑、1 μL的dNTP、4 μL的5×緩沖液、1 μL的RT,最后添加RNase水補(bǔ)足20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件:30 ℃10 min,42 ℃50 min,85 ℃10 min。合成的cDNA保存在-20 ℃冰箱中。取100 ng的cDNA,加入0.4 μL的ROX reference Dye Ⅱ, 上下游引物各0.4 μL, 10 μL的SYBR Premix EX Taq,最后加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火延伸60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt法分析miR-140-5p表達(dá)水平。miR-140-5p上游引物序列為5’-GAGTGTCAGTG GTTTTACCCT-3’,下游為5’-GCAGGGTCCGAGG TATTC-3’;內(nèi)參U6上游引物序列為5’-CTCGCT TCGGCAGCACATATACTA-3’,下游為5’-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’。
1.3.3 ELISA法檢測細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌量 收集4組細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量,按試劑盒說明操作。
1.3.4 Griess法檢測NO生成量 收集4組細(xì)胞培養(yǎng)上清,Griess法測定NO含量,按試劑盒說明操作。
1.3.5 Western blot法檢測細(xì)胞中iNOS和TLR4蛋白的表達(dá) 收集4組細(xì)胞, RIPA裂解,低溫高速離心10 min,吸取上清,以BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品和等體積的Loading Buffer充分混合后,按照每孔40 μg蛋白樣品上樣,SDS-PAGE(100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠)進(jìn)行蛋白分離。將PVDF膜浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中孵育5 min,在50 g/L脫脂奶粉溶液中室溫?fù)u床孵育1 h,再分別置于iNOS和TLR4一抗稀釋液(均按1∶800稀釋)中于4 ℃冰箱中搖床孵育12 h, 然后置于二抗稀釋液(按1∶3 000稀釋)中室溫?fù)u床孵育1 h,ECL發(fā)光,Image J分析。以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。
1.4過表達(dá)TLR4對上調(diào)miR-140-5p表達(dá)的炎癥模型16-HBE細(xì)胞炎癥因子分泌和NO合成的影響將TLR4陰性對照載體和miR-140-5p mimic(miR-140-5p組)、TLR4過表達(dá)載體和miR-140-5p mimic(miR-140-5p+ TLR4)分別共轉(zhuǎn)染到16-HBE細(xì)胞中,培養(yǎng)24 h后,感染RSV(MOI=1)繼續(xù)孵育24 h。檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO含量及細(xì)胞中iNOS、TLR4蛋白表達(dá)水平,操作同上,均重復(fù)3次。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0分析??瞻讓φ战M、RSV組、miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組間miR-140-5p表達(dá)水平,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌量,NO生成量,iNOS和TLR4蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);miR-140-5p組、miR-140-5p+ TLR4組間各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1miR-140-5p與TLR4靶向關(guān)系的驗(yàn)證生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-140-5p和TLR4的3’UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-140-5p mimic和TLR4-3’UTR-WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低(表1)。
圖1 miR-140-5p和TLR4結(jié)合位點(diǎn)示意圖
表1 熒光素酶活性(n=3)
2.2上調(diào)miR-140-5p表達(dá)后炎癥模型細(xì)胞中miR-140-5p和TRL4蛋白表達(dá)水平的變化空白對照組、RSV組、miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組細(xì)胞中miR-140-5p和TRL4蛋白表達(dá)檢測結(jié)果見圖2、表2??梢钥闯觯琺iR-140-5p mimic轉(zhuǎn)染可有效提高miR-140-5p的表達(dá);炎癥模型細(xì)胞中miR-140-5p表達(dá)水平降低;miR-140-5p可負(fù)調(diào)控0炎癥模型細(xì)胞中TRL4蛋白的表達(dá)。
1:空白對照組;2:RSV組;3:miR-NC+RSV組;4:miR-140-5p+RSV組
表2 4組細(xì)胞中miR-140-5p和TRL4蛋白的表達(dá)水平(n=3)
2.3上調(diào)miR-140-5p表達(dá)后炎癥模型細(xì)胞炎癥因子分泌和NO合成能力的變化空白對照組、RSV組、miR-NC+RSV組、miR-140-5p+RSV組細(xì)胞中炎癥因子分泌量、NO生成量和細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平的比較見圖3、表3??梢钥闯觯险{(diào)miR-140-5p表達(dá)可以降低炎癥模型細(xì)胞炎癥因子分泌和NO合成的能力。
1:空白對照組;2:RSV組;3:miR-NC+RSV組;4:miR-140-5p+RSV組
表3 4組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌量,NO生成量及細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)
2.4過表達(dá)TLR4后miR-140-5p表達(dá)上調(diào)的炎癥模型細(xì)胞炎癥因子分泌和NO合成能力的變化miR-140-5p組、miR-140-5p+TLR4組各指標(biāo)測定結(jié)果見圖4、表4??梢钥闯?,TLR4可逆轉(zhuǎn)miR-140-5p誘導(dǎo)的炎癥模型細(xì)胞炎癥因子生成的作用。
1:miR-140-5p組;2:miR-140-5p+TLR4
表4 2組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌量,NO生成量及細(xì)胞中TLR4、iNOS蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)
RSV是一種常見的毛細(xì)支氣管炎病原體。研究[8]顯示,RSV刺激后支氣管上皮細(xì)胞分泌大量的炎癥介質(zhì),誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8是常見的促炎因子,其表達(dá)升高與支氣管哮喘關(guān)系密切[9]。NO是一種重要的信號傳遞分子,也是一種重要的炎癥介質(zhì),與免疫反應(yīng)、神經(jīng)傳導(dǎo)等有關(guān)[10]。研究[11-13]顯示,內(nèi)源性NO是由NOS催化產(chǎn)生的,iNOS是NOS中與炎癥有關(guān)的亞型,其在受到炎癥因子、內(nèi)毒素等刺激以后被激活,從而促使大量NO合成,而過量的NO能夠推動(dòng)炎癥進(jìn)展,誘導(dǎo)哮喘、癌癥、炎癥性腸道疾病等的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,RSV感染后的支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO含量均升高,細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平也升高,提示RSV可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放,說明成功構(gòu)建了支氣管上皮細(xì)胞炎癥模型。
miRNA是一類非編碼的RNA分子,能夠通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮多重作用,在人體組織中普遍表達(dá),參與調(diào)控不同類型細(xì)胞的生長、代謝、衰老、氧化應(yīng)激等生理過程[14]。miR-140-5p是一個(gè)在人體內(nèi)多種組織中表達(dá)的調(diào)節(jié)因子,參與腫瘤生長、關(guān)節(jié)炎進(jìn)展等過程;與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-5]。本研究結(jié)果顯示,miR-140-5p在RSV誘導(dǎo)的炎癥模型支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),而上調(diào)miR-140-5p表達(dá)可以減少炎癥模型細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8,降低細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)并減少NO的合成,說明miR-140-5p可抑制支氣管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放。
本研究還進(jìn)一步探討了miR-140-5p的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)miR-140-5p和TLR4的3’UTR有結(jié)合位點(diǎn),并且上調(diào)miR-140-5p表達(dá)可以降低炎癥模型細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)。TLR是存在于細(xì)胞表面的免疫受體,可以識別某些病原體或某些特定的分子結(jié)構(gòu),引發(fā)炎癥介質(zhì)釋放,參與免疫反應(yīng)過程[15-16]。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TLR家族成員,在幾乎所有的細(xì)胞系中均有表達(dá),可以誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等的表達(dá),放大炎癥信號,激發(fā)炎癥瀑布鏈[17-18]。敲低TLR4能夠抑制RSV誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子的釋放[19]。本研究結(jié)果表明,TLR4可以逆轉(zhuǎn)miR-140-5p誘導(dǎo)的炎癥模型支氣管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放抑制作用,提示上調(diào)miR-140-5p可通過降低TLR4表達(dá)減少支氣管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放。
總之,miR-140-5p在RSV誘導(dǎo)的支氣管炎癥中可能發(fā)揮抑制作用,作用機(jī)制與靶向下調(diào)TLR4的表達(dá)有關(guān),這為miR-140-5p在支氣管炎癥中的應(yīng)用提供了參考。今后我們會(huì)繼續(xù)探討miR-140-5p其他可能的靶向調(diào)控機(jī)制。
鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2021年3期