廖新愛 馮惠娟 卓傳尚 葉治 柳麗娟

在肝癌早期及預(yù)后診斷中缺乏靈敏度和特異度高的診斷標(biāo)志物[1]，因此評(píng)估肝癌風(fēng)險(xiǎn)亟需新的替代或聯(lián)合檢測(cè)標(biāo)志物。

線粒體含有獨(dú)立于核基因組的DNA，稱為線粒體DNA(mtDNA)。由于mtDNA沒有組蛋白，缺乏抗氧化機(jī)制以及有效的修復(fù)系統(tǒng)，因此各種刺激因子的作用容易引起mtDNA產(chǎn)生突變或含量變化，并與癌癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2]。目前，mtDNA含量相關(guān)研究主要集中在癌組織以及外周血單核細(xì)胞(peripherali blood mono-nuclear cell,PBMC)，PBMC mtDNA在一定程度上可以反映組織中mtDNA含量的變化，可用來監(jiān)測(cè)線粒體的損傷以及疾病的發(fā)展情況。已有研究發(fā)現(xiàn)，PBMC mtDNA含量變化與糖尿病、尿毒癥、膿毒血癥以及多種腫瘤發(fā)生及病死率相關(guān)，可作為潛在的生物標(biāo)志物[3-5]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PLC患者及健康人群PBMC中mtDNA變化趨勢(shì)，探討PBMC mtDNA在肝癌診斷中的臨床意義。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年9月至2019年11月在福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院住院治療的PLC患者250例，同期收集健康獻(xiàn)血者48名為健康對(duì)照。PLC患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》。收集所有研究對(duì)象臨床信息及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[總膽紅素(TBil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及乙型肝炎e抗原(HBeAg)等]。本研究通過福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得研究對(duì)象知情同意。

二、檢測(cè)方法及儀器

AU5800全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TBil、ALT、AST等生化指標(biāo)(美國(guó)貝克曼庫爾特公司)；ARCHITECT i2000Sr全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)HBV標(biāo)志物(美國(guó)雅培有限公司)；G1200檢測(cè)AFP(日本富士科技有限公司)。

三、PBMC mtDNA提取及含量測(cè)定

取EDTA-K2抗凝血5 mL，采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll 1.077 g/mL購自GIBCO公司)提取PBMC，基因組DNA(包括mtDNA)的提取參照DNA提取試劑盒說明書(購自中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司)。通過NADH脫氫酶亞基 1(ND1)來確定mtDNA的含量，選用β-globin作為內(nèi)參基因，ND1以及β-globin引物序列參見文獻(xiàn)[6]，引物序列見表1(引物序列由中國(guó)福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL：SYRB的PCR混合液12.5 μL，50×ROX II 0.25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，滅菌ddH2O 10.25-VDNA μL，模板DNA 20 ng。擴(kuò)增條件為：95℃ 20 s預(yù)變性，95℃ 3 s，58℃ 30 s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。線粒體DNA相對(duì)含量表示為2-[Ct(ND1)-Ct(β-globin)]，其中Ct代表標(biāo)本擴(kuò)增曲線中循環(huán)閾值。

表1 PCR引物序列及片段長(zhǎng)度

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、臨床特征

250例PLC患者中，HBsAg陽性233例(93.20%)，HBeAg陽性39例(16.74%)，HBeAg陰性194例(83.26%)。210例(84.00%)有肝硬化背景。PLC患者的男性占比、年齡、血清膽紅素、總蛋白、白蛋白、血清酶學(xué)、AFP相對(duì)含量均高于健康人群。見表2。

表2 PLC患者及健康人群臨床特征比較

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

PBMC提取的DNA與相對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果顯示，所有標(biāo)本mtDNA與核DNA PCR擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)S形，表明所有樣品的目的產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增，即擴(kuò)增效率為100%，擴(kuò)增反應(yīng)良好，陰性對(duì)照無擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可靠。

三、PLC患者和健康人群PBMC mtDNA 相對(duì)含量的比較

分析PLC患者和健康人群PBMC mtDNA ND1基因的相對(duì)含量，結(jié)果顯示：PLC患者PBMC mtDNA相對(duì)含量為90.51 (49.78,165.44)，顯著低于健康人群的456.67(2446.47，1017.60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(W=32579.00，P<0.01)。

四、PLC患者中mtDNA與性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP的相關(guān)分析

由于PBMC mtDNA為非正態(tài)分布連續(xù)性資料，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，PLC患者中PBMC mtDNA與性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP的P值分別為：0.671、0.284、0.184、0.397、0.832，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PBMC mtDNA與患者的性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP均無相關(guān)性。

五、PBMC mtDNA診斷效能評(píng)估

ROC曲線分析結(jié)果顯示，mtDNA診斷PLC的AUC為0.884，高于AFP的0.863，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.493，P=0.622)。mtDNA診斷PLC的最佳cut-off值為F≤164.28，靈敏度為75.20%，略高于AFP的71.70%。mtDNA與AFP二者聯(lián)合診斷可以顯著提高診斷性能，AUC達(dá)0.957，高于mtDNA或AFP單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的效能(z值分別為3.485和1.25，均P<0.01)，靈敏度提高到84.91%，而特異度雖稍降但仍高達(dá)93.18%，見表3。

表3 mtDNA、AFP及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷PLC的性能

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者PBMC mtDNA含量顯著降低，提示mtDNA可能是潛在的肝癌標(biāo)志物[6-8]。本研究結(jié)果顯示PLC患者PBMC mtDNA相對(duì)含量低于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。ROC曲線分析結(jié)果顯示，雖然AFP有較高的AUC和特異度，但是靈敏度只有71.7%，相比較而言，mtDNA用于診斷PLC時(shí)，具有較高的AUC(0.884)和靈敏度(75.20%)。相關(guān)性分析顯示，mtDNA與AFP不相關(guān)，可以互補(bǔ)，二者聯(lián)合檢測(cè)可大大提高對(duì)PLC的診斷性能，AUC提高到0.957，靈敏度達(dá)到84.91%，而特異度略微降低，仍高達(dá)93.18%。

mtDNA作為獨(dú)立于細(xì)胞核染色體外的基因組，受到損傷后其基因發(fā)生突變或水平出現(xiàn)變化[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA含量的增加與罹患非霍奇金淋巴瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌具有相關(guān)性，mtDNA含量減少則可增加罹患軟組織肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)[10-13]。氧化應(yīng)激可引起mtDNA含量變化，mtDNA D-環(huán)區(qū)對(duì)氧化應(yīng)激敏感，易發(fā)生基因突變等損傷，進(jìn)而導(dǎo)致mtDNA含量下降或改變，白細(xì)胞的mtDNA含量受血液循環(huán)中血漿抗氧化劑/氧化劑以及DNA氧化損傷所引起的氧化應(yīng)激的影響[14-16]。另外，細(xì)胞自噬也參與mtDNA含量的調(diào)控，高水平的活性氧(ROS)引起mtDNA損傷，間接引起mtDNA含量的下降[17]。PLC患者PBMC的mtDNA含量降低可能通過改變細(xì)胞能量代謝及機(jī)體抗氧化水平進(jìn)而影響腫瘤免疫。但是，關(guān)于肝癌患者的PBMC mtDNA含量下降的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，有待下一步深入研究。

本研究為單中心的橫斷面研究，可能存在樣本、疾病譜偏差，且缺少相應(yīng)的肝炎和肝硬化患者的隊(duì)列作為相應(yīng)的對(duì)照等，后續(xù)需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本及進(jìn)行多中心研究加以驗(yàn)證?？傊?，本研究的結(jié)果證實(shí)了PLC患者PBMC mtDNA含量較健康人群顯著下降，具有較高的臨床診斷價(jià)值，有望成為新的肝癌血清標(biāo)志物以幫助臨床醫(yī)師在臨床實(shí)踐過程中對(duì)PLC做出診斷。