楊雪 陸觀珠 杜成坎 王博成 許潔 包玉潔

全球每年原發(fā)性肝癌發(fā)病率位居新發(fā)惡性腫瘤的第6位，病死率占惡性腫瘤的第3位[1-2]。肝細(xì)胞癌(HCC)的預(yù)后不良，早期HCC患者可通過手術(shù)切除治愈及改善預(yù)后，但我國(guó)原發(fā)性肝癌患者的5年生存率僅為12%[3]。HCC發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)常已至疾病晚期，嚴(yán)重影響患者長(zhǎng)期生存[4]。因此，提高早期診斷率對(duì)于提高患者預(yù)后具有重要意義。

有研究提示寡糖鏈作為生物標(biāo)志物診斷HCC有著重要的意義[5-8]。本研究使用熒光毛細(xì)血管法寡糖鏈檢測(cè)(G-test)試劑盒對(duì)患者中血清多組寡糖鏈進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討多組寡糖鏈?zhǔn)欠衲軌蜃鳛镠CC診斷的血清標(biāo)志物，并聯(lián)合常用標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)以提高HCC的診斷率。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究為回顧性研究，收集2019年1月至8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院感染科住院的HCC及有高危因素的非HCC慢性肝病患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于18歲；②臨床診斷為HCC患者及考慮存在HCC高危因素的非HCC慢性肝病患者。原發(fā)性HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》，病理診斷為HCC，伴或不伴其他部位轉(zhuǎn)移，慢性乙型病毒性肝炎依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性病毒性肝炎患者；②合并其他部位的原發(fā)性腫瘤；③合并妊娠或者哺乳期婦女；④既往診斷有其他腫瘤；⑤近期有胎盤或含胎盤成分中藥服用者。

三、研究方法

通過對(duì)患者兩種血清標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者對(duì)HCC的診斷價(jià)值：應(yīng)用G-test法寡糖鏈檢測(cè)試劑盒(江蘇,先思達(dá))，使用ABI3500Dx基因分析儀(Applied Biosystems)對(duì)樣本進(jìn)行毛細(xì)管電泳得到糖組學(xué)圖譜，對(duì)檢測(cè)的9個(gè)寡糖鏈組分的含量進(jìn)行圖譜分析，檢測(cè)取G值為5作為標(biāo)準(zhǔn)，≥5為陽(yáng)性，<5為陰性，檢測(cè)在上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。應(yīng)用甲胎蛋白試劑盒(雅培) 使用雅培i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)患者血清中AFP定量值，參考值為0～15 ng/mL，檢測(cè)在上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0(IBM,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ROC曲線進(jìn)行診斷效能分析，采用z檢驗(yàn)比較不同參數(shù)間AUC，采用卡方檢驗(yàn)比較不同組間G-test陽(yáng)性率一致性。使用Mcnemar檢驗(yàn)對(duì)比組間AUC的差異。P<0.05為判定結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的基本資料

本研究數(shù)據(jù)共收集病例73例，確診HCC患者30例及有高危因素的非HCC慢性肝病患者43例的血清樣本，其中男性54例，女性19例，年齡分布24～92歲(中位年齡56歲)(表1)。

表1 研究對(duì)象基本情況

二、G-test和AFP檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)確診的30例HCC患者中使用G-test 檢測(cè)方法陽(yáng)性率90.0%(27/30)，AFP檢測(cè)陽(yáng)性率50.0%(15/30)；非HCC患者中G-test 檢測(cè)方法陽(yáng)性率46.5%(20/43)，AFP在非HCC患者中的陽(yáng)性率13.9%(6/43)(表2)。

表2 G-test和甲胎蛋白的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，非HCC組G test陽(yáng)性率低于HCC組，P=0.000，非HCC組AFP陽(yáng)性率低于HCC組，P=0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

通過卡方檢驗(yàn)，兩組間性別、ALT分布未見顯著性差異(P>0.05)。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，HCC組年齡高于非HCC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

通過ROC曲線下面積計(jì)算，單獨(dú)檢測(cè)G-test(AUC=0.701)或AFP (AUC=0.680)診斷HCC的敏感性，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.7648)(圖1)。

單獨(dú)檢測(cè)G-test的AUC為0.701，單獨(dú)檢測(cè)AFP的AUC為0.680。使用Z檢驗(yàn)，兩方法間AUC的P值為0.7648，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖1 獨(dú)立檢測(cè)G-test或AFP診斷AFP的靈敏度檢測(cè)

進(jìn)一步對(duì)比兩者在肝細(xì)胞癌診斷中的特異度和靈敏度，并使用Mcnemar檢驗(yàn)兩者之間的差異。在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，特異度為53.5%；AFP的靈敏度為50.0%，特異度為86.0%(P<0.05)。以上結(jié)果提示G-test的靈敏度顯著高于AFP (P=0.003)，而AFP的特異度高于G-test (P=0.003)(表3)。

表3 兩種血清標(biāo)志物診斷效能評(píng)價(jià)

使用Mcnemar檢驗(yàn)，在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，特異度為53.5%，P<0.05；AFP的靈敏度為50.0%，特異度為86.0%，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、G-test及AFP聯(lián)合診斷的結(jié)果

對(duì)G-test與AFP同時(shí)陽(yáng)性，或兩者之間有一項(xiàng)陽(yáng)性的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：經(jīng)確診的30例HCC患者中，G-test和AFP均陽(yáng)性46.7%(14/30)，G-test和AFP均陰性為10.0%(3/30)，G-test或AFP陽(yáng)性為43.3%(13/30)；非HCC患者中，G-test和AFP均陽(yáng)性0%(0/43)，G-test和AFP均陰性為39.5%(17/43)，G-test或AFP陽(yáng)性為60.5%(26/43)(表4)。

表4 G-test及AFP聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

對(duì)兩組檢測(cè)方法得到的結(jié)果計(jì)算受試者操作特征曲線(ROC)下面積(AUC)，得到：G-test陽(yáng)性或AFP陽(yáng)性的AUC為0.671，兩者同時(shí)陽(yáng)性的AUC為0.698。G-test陽(yáng)性或AFP陽(yáng)性的患者同時(shí)陽(yáng)性的靈敏度最高，達(dá)90.0%，兩者同時(shí)陽(yáng)性的特異度最高，為93.0% (圖2，表5)。

受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)，得到：G-test陽(yáng)性或AFP陽(yáng)性的AUC為0.671，兩者同時(shí)陽(yáng)性的AUC為0.698。圖2 G-test及AFP聯(lián)合檢測(cè)受試者工作特征曲線下面積(ROC-AUC)

采用Mcnemar檢驗(yàn)分析，G-test陽(yáng)性或AFP陽(yáng)性診斷靈敏度高于單獨(dú)測(cè)AFP陽(yáng)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，甲胎蛋白特異度高于G-test陽(yáng)性或AFP陽(yáng)性(P<0.05)。G-test和AFP均陽(yáng)性的靈敏度與單獨(dú)AFP陽(yáng)性未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，G-test和AFP均陽(yáng)性的特異度度與單獨(dú)AFP陽(yáng)性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表5)。

表5 G-test及AFP單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷效能評(píng)價(jià)

經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，HCC組兩診斷皆為陽(yáng)性率高于非HCC組，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HCC組兩診斷皆為陰性率低于非HCC組，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

由于AFP異質(zhì)體以及膽管細(xì)胞癌中AFP陰性表達(dá)，導(dǎo)致AFP用于診斷HCC時(shí)，部分患者出現(xiàn)假陰性。對(duì)這部分患者的診斷亟需篩選新的敏感的標(biāo)志物以提高其診出率[9]。

糖基化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，糖蛋白的N-糖基化分布的改變?cè)趷盒阅[瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，已有一些糖蛋白作為卵巢癌和乳腺癌生物標(biāo)志物[10-11]。既往有研究發(fā)現(xiàn)糖組學(xué)的改變與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，LIU等人發(fā)現(xiàn)，在慢性肝病患者與HCC患者血清中N-聚糖之間差異分析，有57種N-聚糖豐度發(fā)生顯著變化[12]。隨后許多研究證實(shí)特異性N-聚糖變化與HCC發(fā)生相關(guān)，提示N-聚糖作為生物標(biāo)志物診斷HCC有著重要的意義[5-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用G-test法對(duì)寡糖鏈進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)血清中N-糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記后檢測(cè)得到糖組學(xué)圖譜，并對(duì)其結(jié)果分析后得到G值對(duì)診斷HCC具有較好的診斷意義：針對(duì)本次樣本中的檢測(cè)，單獨(dú)檢測(cè)G-test的AUC為0.701，單獨(dú)檢測(cè)AFP的AUC為0.680。使用Z檢驗(yàn)，兩方法間AUC的P值為0.7648。未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示G-test與AFP兩種方式均可作為HCC診斷的血清標(biāo)志物。但結(jié)果顯示：在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，顯著高于AFP (P=0.003)，更適用于篩選肝細(xì)胞癌患者，而AFP的特異度為86.5%，高于G-test (P<0.05)，更適用于排除肝細(xì)胞癌診斷；兩種檢測(cè)方式單獨(dú)使用時(shí)均存在一定的不足。當(dāng)同時(shí)使用兩種檢測(cè)方式，且 G-test和AFP二者均為陽(yáng)性時(shí)，診斷患者HCC的靈敏度可達(dá)90.0% ，特異度達(dá)93.0%，且兩者同時(shí)陽(yáng)性的特異度為74.0%。提示兩種檢測(cè)方式聯(lián)合使用時(shí)，可更準(zhǔn)確地提高HCC的診斷，減少誤診率和漏診率。因此，本研究結(jié)果提示G-test聯(lián)合AFP檢測(cè)可以作為一種非創(chuàng)傷性的檢測(cè)手段，提高HCC的診斷效力。作為一種血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)，該方法更方便易行，兩者聯(lián)合進(jìn)行HCC診斷突顯出其獨(dú)特的優(yōu)越性，更有利于在高危因素患者隨訪過程中使用。

本研究樣本量較少，后續(xù)筆者會(huì)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證本研究結(jié)果。其次，本研究持續(xù)時(shí)間較短，未能追蹤高危患者中G-test陽(yáng)性高?；颊叩腍CC發(fā)病情況。在未來(lái)的研究中有必要開展大樣本多中心前瞻性研究確證本研究結(jié)果。