任雪石凱欣張震徐陽(yáng)潘思軼

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

《中國(guó)藥典》2015年版中記載，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”，因廣陳皮獨(dú)特的藥用價(jià)值，區(qū)別于其他陳皮。多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones，PMFs)是柑橘屬所特有的一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物[1]，主要分布在果皮油胞層部位，具有消炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基等生理活性[2]，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心肺也具有一定的保健作用[3]。Li等[4]研究表明大鼠巨噬細(xì)胞中的IL-α、IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)可以被PMFs抑制，川陳皮素可調(diào)節(jié)COX-2的活性，抑制PGE2的合成，最后達(dá)到抑制關(guān)節(jié)軟骨降解、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥的效果。研究最廣泛的PMFs單體是川陳皮素(nobiletin，NOB)和桔皮素(tangeretin，TAN)，其在柑橘中含量更豐富，并且均表現(xiàn)出良好的藥理活性。Parkar等[5]建立糖尿病大鼠模型，研究川陳皮素對(duì)心血管的保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)川陳皮素可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及炎癥信號(hào)通路的表達(dá)，使大鼠的心血管功能得到改善。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是肺部炎癥疾病的典型代表之一，目前臨床上多采用機(jī)械通氣和化學(xué)藥物進(jìn)行緩解，尚無(wú)特效的治療方法[6]，長(zhǎng)期使用藥物可能會(huì)再次誘發(fā)肺部炎癥并加重ALI。引起ALI的原因很多，其中脂多糖是試驗(yàn)中最常采用的誘導(dǎo)因素之一。脂多糖(lipopolisaccharide，LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，進(jìn)入機(jī)體后與細(xì)胞表面的Toll-樣受體4結(jié)合，經(jīng)MyD88依賴(lài)的信號(hào)通路的活化及細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，最終激活以NF-κB為主的核內(nèi)因子，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[7]，形成復(fù)雜的系統(tǒng)炎癥效應(yīng)，最終導(dǎo)致肺組織和細(xì)胞的損傷。PMFs的生物活性已有相關(guān)研究報(bào)道，但PMFs提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)作用知之甚少。因此，本研究通過(guò)LPS構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型，分析PMFs提取物對(duì)急性肺損傷小鼠的抗氧化和抗炎效果，并探討PMFs提取物中對(duì)小鼠急性肺損傷起到保護(hù)作用的關(guān)鍵功能因子，為PMFs功能性成分的開(kāi)發(fā)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

4周齡SPF級(jí)雄性昆明種小鼠84只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0019。

廣陳皮(15年茶枝柑干燥果皮)，產(chǎn)自廣東省江門(mén)市新會(huì)區(qū)；MPO、GSH-PX、MDA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β細(xì)胞因子ELISA試劑盒，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他試劑為分析純和色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀，布魯克公司；離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；e2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；HTX多功能酶標(biāo)儀，基因有限公司；超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1)廣陳皮中PMFs的提取。將廣陳皮粉碎，過(guò)2遍孔徑0.25 mm篩。稱(chēng)取20 g廣陳皮粉，料液比1∶20(g/mL)，提取溶劑為90%乙醇，震蕩混合均勻置搖床中于45 ℃震蕩30 min，之后超聲提取30 min(100 W，45 ℃)。將粗提液抽濾3次至澄清透明，濾渣重新加入90%乙醇重復(fù)上述操作。合并2次乙醇提取液，45 ℃真空旋蒸，加入蒸餾水分散攪勻，冷凍干燥，獲得PMFs粗提物，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

2)PMFs的純化。稱(chēng)取PMFs粗提物溶于40%乙醇，上樣體積250 mL，上樣流速0.8 L/h，吸附后，用43%乙醇洗脫柱子，洗脫速度1.2 L/h，洗脫體積2.4 L，再用90%乙醇解吸，解吸速度1.2 L/h，解吸體積2 L，獲得富含目標(biāo)物質(zhì)的純化液，45 ℃真空旋蒸，冷凍干燥，獲得PMFs提取物，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

3)川陳皮素和桔皮素的制備及結(jié)構(gòu)鑒定。高速逆流色譜采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶0.8∶1∶1，V/V)的溶劑體系，將4種溶液按比例加入分液漏斗，混勻后靜置分層，上下相分別為固定相和流動(dòng)相，兩相分別超聲脫氣30 min備用。另稱(chēng)取360 mg PMFs粗提物，溶于18 mL下相，4 000 r/min離心得20 mg/mL樣液。以30 mL/min將上相泵入分離管中，800 r/min，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，之后以3 mL/min注入下相，兩相平衡后由進(jìn)樣閥注入18 mL樣液，通過(guò)紫外檢測(cè)器于330 nm檢測(cè)流出物，按照色譜峰接收目標(biāo)餾分，分離溫度25 ℃，再45 ℃真空旋蒸，冷凍干燥，獲得目標(biāo)物單體，之后通過(guò)質(zhì)譜儀和核磁共振譜儀對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

UPLC-MS條件：ACQUITY UPLC-BEH C18(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水(0.1%甲酸)，洗脫梯度：0～6 min，25%～50%乙腈；6～14 min，50%～60%乙腈，流速0.21 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，ESI離子源，正離子模式，離子源溫度135 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速600 L/h，毛細(xì)管電壓3.00 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，單次掃描時(shí)間為1 s。

1H NMR條件：5 mm 核磁管，頻率600 MHz，溶劑CDCl3(1%TMS)，控溫精度±0.1 ℃，磁場(chǎng)強(qiáng)度14.1 T，分辨率R≤0.60 Hz，靈敏度S/N≥900∶1，掃描2次。

4)川陳皮素和桔皮素的純度鑒定。高效液相色譜條件：Agilent C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水(0.4%甲酸)，洗脫梯度：0～15 min，25%～50%乙腈；15～35 min，50%～60%乙腈；流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量10 μL。

5)動(dòng)物飼養(yǎng)、造模及分組。在Ye等[8]的研究方法基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改。84只健康雄性昆明小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，隨機(jī)分成7組(n=12)：對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、NOB低劑量組(25 mg/kg)、NOB中劑量組(50 mg/kg)、NOB高劑量組(100 mg/kg)和PMFs提取物組(250 mg/kg)。在LPS滴鼻誘導(dǎo)前對(duì)川陳皮素高、中、低劑量組和PMFs提取物組連續(xù)灌胃7 d，每天固定時(shí)間給藥1次，同時(shí)對(duì)照組、模型組和陽(yáng)性對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照組在第7 天造模前腹腔注射地塞米松磷酸鈉(10 mg/kg)，1 h后對(duì)模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、NOB高中低劑量組和PMFs提取物組滴鼻LPS(8 mg/kg)溶液，空白組給予同體積的生理鹽水。造模6 h后處死。該研究獲得了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的倫理學(xué)批準(zhǔn)。

6)樣本采集。小鼠眼眶靜脈叢取血，室溫靜置1 h，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，獲得小鼠血清，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ竺擃i處死，快速取出完整肺組織，于冰冷的滅菌生理鹽水中迅速漂洗干凈，用濾紙吸取多余水分。取右肺上葉組織放入4%多聚甲醛液中固定，室溫保存，用于組織病理學(xué)觀察；左肺用于測(cè)定肺濕/干質(zhì)量比；其余肺組織立即放入液氮，試驗(yàn)結(jié)束后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，備用。

7)肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分。將固定24 h后的右肺上葉組織取出，脫水、包埋、切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。參照Nishina等[9]介紹的方法進(jìn)行肺損傷評(píng)分，每張切片選擇3個(gè)不同視野，取平均值統(tǒng)計(jì)分析。

8)肺濕/干質(zhì)量比。將取出的左肺在生理鹽水漂洗過(guò)后，用濾紙吸干肺組織表面水分，稱(chēng)濕質(zhì)量，之后放入60 ℃的烘箱中，烘干48 h，再次稱(chēng)肺組織干質(zhì)量，2組數(shù)據(jù)相除后所得即為濕/干質(zhì)量比(W/D)。

9)肺組織中氧化損傷指標(biāo)的測(cè)定。從-80 ℃冰箱中取出適量肺組織，制備肺組織勻漿。嚴(yán)格按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒制造商的說(shuō)明書(shū)，測(cè)量肺組織勻漿液中蛋白質(zhì)的水平。MDA、MPO、GSH-PX均可通過(guò)試劑盒顯色作用呈現(xiàn)出特殊顏色，通過(guò)特定波長(zhǎng)可檢測(cè)出吸光度，再與標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合測(cè)定樣品MDA、MPO、GSH-PX的含量或活力。

10)血清中細(xì)胞因子含量的測(cè)定。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)各小組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其分泌量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 D101大孔吸附樹(shù)脂的分離純化

將純化前后的PMFs粗提物溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過(guò)D101大孔樹(shù)脂吸附后，廣陳皮PMFs粗提物中PMFs成分種類(lèi)未出現(xiàn)顯著增加或減少，PMFs較完整地保留下來(lái)，主要為川陳皮素和桔皮素，而極性較大物質(zhì)如色素、黃烷酮等其他雜質(zhì)成分經(jīng)過(guò)純化后明顯減少，樣液顏色淺而澄清。D101大孔樹(shù)脂吸附前后粗提物中PMFs的組分及含量變化情況如表1所示。富集后川陳皮素和桔皮素分別增加了3.7倍和3.1倍，可知D101大孔樹(shù)脂可以有效吸附PMFs，實(shí)現(xiàn)富集純化。

圖1 D101大孔樹(shù)脂吸附PMFs粗提物前(A)、吸附后(B)、川陳皮素標(biāo)品(C)、桔皮素標(biāo)品(D)的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of D101 resin absorbed PMFs before (A),after (B),nobiletin standard (C) and tangeretin standard (D)

表1 D101大孔吸附樹(shù)脂富集前后PMFs粗提物的含量變化Table 1 Changes of PMFs extract contentbefore and after enrichment by D101 resin

2.2 高速逆流色譜制備川陳皮素和桔皮素

用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶0.8∶1∶1，V/V)體系分離PMFs粗提物的川陳皮素和桔皮素，分離時(shí)間為240 min，經(jīng)分離得到2個(gè)主要峰：峰A和峰B，保留率73%，分離效果良好。根據(jù)色譜分段收集并檢測(cè)，峰A和峰B 2個(gè)化合物的純度分別為95.08%和98.01%，結(jié)果見(jiàn)圖2。旋蒸去溶劑后凍干稱(chēng)質(zhì)量，分別為7.12、5.83 mg。

圖2 HSCCC主要峰(A，B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the main peaks (A,B) of HSCCC

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)圖2中的峰A和峰B進(jìn)行1H NMR和UPLC-QTOF-MS/MS測(cè)定，結(jié)果如下：

峰A：ESI-MS (m/z)：403[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ 7.58 (dd,J=8.4,2.1 Hz,1H)，7.42 (d,J=2.1 Hz,1H)，7.00 (d,J=8.4 Hz,1H)，6.63 (s,1H)，4.11 (s,3H)，4.03 (s,3H)，4.01～3.94 (m,12H)。其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道對(duì)照基本一致，故組分A鑒定為川陳皮素。

峰B：ESI-MS (m/z)：373[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ 7.88 (d,J=9.0 Hz,2H)，7.03 (d,J=9.1 Hz,2H)，6.61 (s,1H)，4.10 (s,3H)，4.02 (s,3H)，3.95 (d,J=0.8 Hz,6H)，3.89 (s,3H)。其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道對(duì)照基本一致，故組分B鑒定為桔皮素。

通過(guò)以上分析結(jié)果可知，在PMFs提取物中80%約為川陳皮素和桔皮素的混合物，其中川陳皮素含量約占50%，桔皮素約占30%，說(shuō)明川陳皮素是廣陳皮中主要的PMFs，且所得川陳皮素純度可達(dá)95%以上。

2.4 ALI小鼠肺組織病理學(xué)觀察

LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的嚴(yán)重程度可以通過(guò)肺組織的病理學(xué)觀察反映出來(lái)。如圖3所示，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，肺泡腔清晰可見(jiàn)，未出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組對(duì)比，模型組小鼠在LPS滴鼻6 h之后肺組織中肺泡壁和間隔增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷明顯，肺損傷評(píng)分顯著升高，說(shuō)明造模成功。與模型組相比，中劑量川陳皮素組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為正常，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，無(wú)明顯病理性損傷，可初步推測(cè)川陳皮素對(duì)急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.5 ALI小鼠肺損傷評(píng)分和肺組織濕/干質(zhì)量比

肺的濕/干質(zhì)量比可以反映肺水腫的嚴(yán)重程度。如圖4所示，模型組肺組織濕/干質(zhì)量比明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。相比之下，中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組有效降低了LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織的濕/干質(zhì)量比(P<0.01)。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:陽(yáng)性對(duì)照組;D:25 mg/kg NOB低劑量組;E:50 mg/kg NOB中劑量組;F:100 mg/kg NOB高劑量組;G:250 mg/kg PMFs提取物組。A:Control group;B:Model group;C:DEX group;D:25 mg/kg NOB group;E:50 mg/kg NOB group;F:100 mg/kg NOB group;G:250 mg/kg PMFs group.

*(P<0.05) 或**(P<0.01)表示和對(duì)照組相比，#(P<0.05)或##(P<0.01)表示和LPS組相比。下同。*(P<0.05) or **(P<0.01) compared with control group,# (P<0.05) and ## (P<0.01) compared with the LPS group. The same as below.

2.6 ALI小鼠肺組織氧化損傷指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組的MPO活性和MDA含量顯著上升(P<0.01)，GSH-PX的活性顯著下降(P<0.01)。然而，中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組使MPO和MDA的含量和活性顯著下降，GSH-PX的活性顯著上升。

圖5 NOB和PMFs作用下的ALI小鼠肺組織中MDA(A)、MPO(B)和GSH-PX(C)的活性變化Fig.5 Changes of MDA(A),MPO(B) and GSH-PX(C) in lung tissue of ALI mice under the action of NOB and PMFs

2.7 ALI小鼠血清中細(xì)胞因子含量

為評(píng)估LPS刺激下炎癥細(xì)胞因子的水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定TNF-α、IL-6和 IL-1β在蛋白水平上的表達(dá)。如圖6所示，與對(duì)照組相比，LPS可顯著增加TNF-α、IL-6和IL-1β促炎因子的含量(P<0.01)。高、低劑量川陳皮素組對(duì)于降低TNF-α的含量沒(méi)有顯著性差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組則顯著改善模型組炎癥因子的表達(dá)(P<0.01)，阻止這些炎癥細(xì)胞因子的釋放。

圖6 NOB和PMFs作用下的ALI小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量變化Fig.6 Changes of TNF-α,IL-6 and IL-1βcontentin serum of ALI mice under the action of NOB and PMFs

3 討 論

3.1 PMFs對(duì)小鼠肺組織損傷程度、肺組織濕/干質(zhì)量比的影響

本研究表明，LPS的刺激導(dǎo)致了以肺泡為主的炎性肺損傷，肺組織病理特征異常改變，氧化損傷指標(biāo)和促炎因子顯著上升，主要是中性粒細(xì)胞的活化會(huì)促進(jìn)肺部細(xì)胞毒產(chǎn)物的表達(dá)，如機(jī)體氧自由基和顆粒酶的過(guò)量產(chǎn)生。Chignard等[13]研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可以增加ALI小鼠肺屏障通透性，本研究也證實(shí)小鼠經(jīng)LPS滴鼻后，肺組織被大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。而經(jīng)過(guò)連續(xù)灌胃7 d的小鼠情況有所好轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)PMFs提取物和川陳皮素可有效緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷，減少中性粒細(xì)胞聚集，降低肺濕/干質(zhì)量比，說(shuō)明PMFs提取物和川陳皮素可防止富含蛋白質(zhì)的水腫液滲透到肺組織中。這與Li等[14]采用20 mg/kg川陳皮素滴鼻后，肺濕/干質(zhì)量比也顯著下降的研究結(jié)果一致，說(shuō)明川陳皮素和PMFs對(duì)小鼠肺組織具有一定的保護(hù)作用。

3.2 PMFs對(duì)小鼠肺組織氧化損傷指標(biāo)的影響

本研究結(jié)果表明，PMFs提取物和川陳皮素使MDA含量和MPO活性下降，GSH-PX活性上升。這與Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，同時(shí)降低MPO活性的研究是類(lèi)似的。由此推測(cè)，川陳皮素和PMFs可以通過(guò)減少氧自由基生成、減弱肺組織的中性粒細(xì)胞的積累，起到保護(hù)小鼠肺組織的作用。同時(shí)，細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)被細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化破壞后能進(jìn)一步損傷肺泡中的毛細(xì)血管，使血管滲透性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞完整性被破壞，導(dǎo)致水和大分子成分外滲[16]，最后形成肺水腫，這與上述研究結(jié)果也吻合。

3.3 PMFs對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響

細(xì)胞因子分析結(jié)果表明,PMFs提取物和川陳皮素可顯著緩解LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子的產(chǎn)生。Liu等[17]采用橙皮苷灌胃ALI小鼠，測(cè)定4 h和24 h肺泡灌洗液中的TNF-α和 IL-6含量，同樣發(fā)現(xiàn)其能夠顯著降低促炎因子的表達(dá)。說(shuō)明黃酮類(lèi)化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有一定的抗炎作用。因PMFs特殊的結(jié)構(gòu)，相比于黃酮類(lèi)化合物，多甲氧基基團(tuán)的低極性決定了其具有高疏水特性及較強(qiáng)的滲透性，更易穿過(guò)磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)揮作用，被人體吸收，促進(jìn)細(xì)胞的代謝活力，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗炎效果。

PMFs在生物體內(nèi)發(fā)生的生物轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物也可能對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI具有一定的抑制作用。早期研究顯示桔皮素能以非競(jìng)爭(zhēng)方式抑制某些細(xì)胞色素P450酶在人肝臟微粒體中的表達(dá)[18]。PMFs代謝的關(guān)鍵酶系就是細(xì)胞色素P450，能催化羥基化和去甲基化反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素的去甲氧基速度緩慢，半衰期達(dá)24 h以上，表明其在體內(nèi)的半衰期可能相當(dāng)長(zhǎng)。Obermeier等[19]研究發(fā)現(xiàn)3′-去甲氧基川陳皮素、4′-去甲氧基川陳皮素和3′，4′-二羥基-5，6，7，8-四甲氧基黃酮是川陳皮素在CD-1小鼠尿樣和血漿中的代謝產(chǎn)物，并且這些代謝產(chǎn)物與其母體化合物川陳皮素相比，對(duì)LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2表達(dá)具有更強(qiáng)的抑制作用。由此推測(cè)川陳皮素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷可能是與代謝產(chǎn)物共同作用的結(jié)果。

上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMFs提取物組和不同劑量川陳皮素組對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)效果從高到低依次是：中劑量組、PMFs提取物組、高劑量組和低劑量組。推測(cè)高劑量組效果不如中劑量組的原因可能是50 mg/kg已達(dá)到川陳皮素發(fā)揮作用的最大值，超過(guò)該值后作用效果減弱或趨于無(wú)效。另外，也可能是劑量過(guò)大抑制了相關(guān)信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[20]，導(dǎo)致效果下降。早期體外吸收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，川陳皮素優(yōu)先沉積在Caco-2細(xì)胞單層中[21]，孵育4 h后發(fā)現(xiàn)48%以上的川陳皮素滲透入基側(cè)(門(mén)靜脈)內(nèi)，說(shuō)明川陳皮素具有高度滲透性能，更容易在細(xì)胞內(nèi)沉積。由此推測(cè)，滲透率可能是導(dǎo)致中劑量組川陳皮素比PMFs提取物組作用效果稍強(qiáng)的原因之一。

本試驗(yàn)從廣陳皮PMFs提取物出發(fā)，與現(xiàn)有研究直接用標(biāo)準(zhǔn)品灌胃相比，能更加真實(shí)客觀地反映廣陳皮中功能因子對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用，并與川陳皮素進(jìn)行對(duì)比，研究二者的差異，為廣陳皮中功能性成分的開(kāi)發(fā)和研究提供理論參考。試驗(yàn)結(jié)果表明，PMFs提取物可通過(guò)抑制誘因，減弱或消除氧自由基、促炎細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放導(dǎo)致的損傷，改善微循環(huán)，起到對(duì)肺組織細(xì)胞的保護(hù)作用。此外，對(duì)比PMFs提取物，川陳皮素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用更強(qiáng)，推測(cè)川陳皮素可能是PMFs提取物中的主要功能因子。今后還需進(jìn)一步探討川陳皮素對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響以及對(duì)MAPK和NF-κB等信號(hào)通路的作用機(jī)制。