王曦

摘? 要：試驗旨在探究腸炎沙門氏菌攻毒對SPF雛雞糞便微生物區(qū)系的影響。選擇1日齡SPF雛雞24只，隨機分為2組，每組12只。在4日齡處理組口服107 CFU腸炎沙門氏菌（ATCC13076）攻毒，對照組口服等量PBS溶液。試驗期22 d。結果顯示：①處理組SPF雞的存活率為75%，對照組全部存活，期間兩組雞的體重無顯著性差異;②OTU水平上，相同日齡兩組雞糞便菌群的豐富度相近，中期處理組糞便菌群多樣性更高（P<0.05），后期對照組菌群穩(wěn)定性更高，而且攻毒對SPF雞糞便菌群的影響隨日齡增加而減弱;③在屬水平上，與對照組相比，處理組Bacteroides（擬桿菌門）、Enterococcus（腸球菌屬）和Aeriscardovia（卡多維亞氏菌屬）的相對豐度明顯升高（P<0.05）;Lactobacillus（乳桿菌屬）、Alistipes（另枝菌屬）、Faecalibacterium（糞桿菌屬）、Romboutsia（羅姆布茨菌屬）和Ruminococcaceae_UCG_005（瘤胃球菌UCG_005）的相對豐度明顯降低（P<0.05）;④KEGG分析顯示攻毒影響了菌群參與的多個代謝通路。綜上，腸炎沙門氏菌感染影響了SPF雛雞糞便菌群的結構組成、穩(wěn)定性及菌群參與的代謝通路。Bacteroides（擬桿菌門）、Lactobacillus（乳桿菌屬）等差異菌屬可能對SPF雛雞抵抗沙門氏菌入侵起到積極作用。

關鍵詞：腸炎沙門氏菌;SPF雛雞;16S rRNA測序;糞便菌群;KEGG代謝通路

動物腸道中含有極其復雜的共生微生物群組分，其抵抗病原菌入侵產(chǎn)生的定殖抗性對宿主的健康起到保護作用[1]。腸道微生物的組成會隨著時間的推移而發(fā)展[2]，也會隨著病原菌入侵而發(fā)生變化[3]。腸炎沙門氏菌是一種常見人畜共患病的腸道病原體，引起宿主腸道炎癥反應，臨床表現(xiàn)一般為腹瀉。在腹瀉癥狀消失后，腸炎沙門氏菌可以在宿主體內(nèi)隱性攜帶，并伴隨著長期的間歇性排菌[4]。在剛孵化的SPF雞腸道菌群單一的窗口期引入腸炎沙門氏菌，使其更容易引起腸道菌群結構的變化[5]。而我們感興趣的是早期腸炎沙門氏菌感染對SPF雛雞糞便菌群結構產(chǎn)生怎樣的影響。本研究利用16S rRNA基因高通量測序技術來探究腸炎沙門氏菌攻毒對SPF雛雞糞便菌群的影響，并結合日齡來研究糞便菌群的相關性變化。

1? 材料和方法

1.1? 試驗設計與試驗動物? 試驗選取山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞胚場孵化的1日齡SPF雛雞24只，隨機分成兩組，每組12只，其中處理組在4日齡時口服0.2 mL（約107CFU）的腸炎沙門氏菌（ATCC13076），對照組口服等量無菌PBS溶液，分別在隔離器內(nèi)隔離飼養(yǎng)，正常飼喂雛雞飼料和飲水。

1.2? 生存曲線、體重與糞便樣品采集? 每天觀察雞的生長情況，實驗結束后繪制生存曲線。在第1、4、5、7、9、11、14、18和22日齡時稱量每組雞的體重。在第5、7、9、18和22日齡收集兩組SPF雞的糞便，每組隨機采集6份新鮮糞便，每份都收集到一個5 mL離心管里，加入少量PBS緩沖液混勻后，-20℃保存，用于檢測糞便菌群多樣性。

1.3? 糞便菌群16S rRNA高通量測序及分析

1.3.1? DNA提取和PCR擴增? 根據(jù)E.Z.N.A.soil試劑盒（Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.） 說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，用338F（5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R （5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對 V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABIGeneAmp？9700型）。擴增體系為20 μL，4 μL 5×Fast Pfu緩沖液、2 μL 2.5 mMdNTPs、0.8 μL引物（5 μM）、0.4 μLFastPfu聚合酶和10 ngDNA模板。

1.3.2? Illumina Miseq測序? 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City， CA， USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega， USA） 進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺 （Illumina，San Diego， USA）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4? 數(shù)據(jù)處理與分析? 測序序列使用 Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接：①設置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于50 bp的序列;②barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基;③根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp，去除無法拼接的序列。使用的UPARSE 軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設置比對閾值為70%。主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）、線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）、冗余分析（Redundancy analysis，RDA）和PICRUSt功能預測分析在上海美吉生物免費云平臺進行（https：//www.i-sanger.com/）。變異系數(shù)（coefficient of variation， CV）為標準差與平均值的商（SD/Mean）。在軟件GraphPad Prism7中利用Mann-Whitney 算法進行差異顯著性檢驗。

2? 結果和分析

2.1? 生存曲線與體重變化? 對照組存活率為100%，處理組存活率為75%，見圖1。在14～22日齡，處理組SPF雛雞的均重都大于對照組，但沒有顯著性差異（P>0.05），見表1。

2.2? 16S rRNA基因高通量測序數(shù)據(jù)分析

2.2.1? OTU水平上糞便菌群結構與差異分析? 在方法與材料中已經(jīng)列出了兩組SPF雞5個時間點的糞便樣本。在進行Illumina MiSeq測序和質量過濾后，為了降低每個糞便樣本間的測序深度差異造成的影響，這些序列被統(tǒng)一抽平至樣本中最小序列數(shù)（每個樣本28423個序列）。OTU水平上，兩組在5個日齡除了重疊的OTU，各自都含有差異OTU，見表2。

通過α多樣性分析比較了兩組糞便樣本的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，發(fā)現(xiàn)比較相同日齡處理組與對照組糞便菌群Chao指數(shù)始終無顯著性差異，見表3;而在第5、9、18日齡時處理組的Shannon指數(shù)顯著大于對照組，見表4。

Chao和Shannon指數(shù)變異系數(shù)用來衡量SPF雞糞便菌群的穩(wěn)定性。結果發(fā)現(xiàn)，對照組糞便菌群的穩(wěn)定性大于處理組，見圖2。

基于Brays-Curtis 算法的主坐標分析樣本的β多樣性。根據(jù)組別和年齡所有樣本均可以分為10個不同的小組，在PCoA圖上對日齡的分析顯示出樣品的異質分布，隨著時間的推移，兩組的群落結構愈加相似，見圖3A;另一方面，考慮到攻毒的PCoA分析表明，在每個采樣時間點，處理組和對照組的細菌群落結構明顯不同，見圖3B。

2.2.2? 門、屬級糞便菌群結構組成與差異分析? 在門分類水平上，兩組的菌門（相對豐度>1%）都由Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Proteobacteria（變形菌門）組成，見圖4A和4B。

Actinobacteria與Proteobacteria的平均相對豐度在兩組均處于較低水平。兩組中Firmicutes的相對豐度均在18日齡之前超過95%，從第18日齡起，兩組Firmicutes的相對豐度開始下降的同時，伴隨著Bacteroidetes的相對豐度迅速上升。18～22日齡，處理組的Firmicutes平均相對豐度極顯著低于對照組（P<0.01），處理組的Bacteroidetes平均相對豐度極顯著高于對照組（P<0.01），見圖5。

在屬分類水平，有24個屬的細菌相對豐度在兩組樣本中曾大于1%，在第7日齡之前，兩組糞便菌群都比較單一，第9日齡之后菌群多樣性迅速上升。兩組的糞便菌群主要由Lactobacillus（乳桿菌屬）細菌組成，處理組糞便菌群含有更多的Bacteroides（擬桿菌屬）和Enterococcus（腸球菌屬）細，而對照組Alistipes、Romboutsia和Faecalibacterium等菌屬更加豐富。在第5～18日齡，Lactobacillus都是最豐富的屬，豐度隨時間推移而緩緩降低。第22日齡，處理組中Bacteroides相對豐度最高，約25.8%;在處理組中Alistipes相對豐度最高，約18.5%，結果見圖4C。

使用LEfSe分析比較了在同一日齡兩組間的差異菌群。在第5和7日齡無差異菌屬（閾值≥4），所以只呈現(xiàn)了第9、18、22日齡的LDA得分。我們發(fā)現(xiàn)在這3個日齡中共出現(xiàn)了8個差異菌屬（見圖6A～C），處理組處于優(yōu)勢水平的有3個菌屬，分別是Enterococcus、Aeriscardovia和Bacteroides。對照組處于優(yōu)勢水平的有5個菌屬，分別是Romboutsia、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG_005、Faecali-bacterium和Alistipes。基于LDA得分進行RDA分析，表明腸炎沙門氏菌攻毒影響了SPF雛雞腸道菌群結構，且腸炎沙門氏菌攻毒與Ruminococcaceae_UCG_005、Romboutsia、Faecali-bacterium、Alistipes和Lactobacillus成負相關，與Enterococcus、Bacteroides和Aeriscardovia成正相關，見圖6D。

通過LEfSe分析得出了差異菌屬在不同日齡的豐度變化。處理組中Enterococcus在9日齡之后持續(xù)處于較高豐度水平且顯著高于對照組;Aeriscardovia的豐度在9～18日齡顯著高于對照組，Bacteroides的豐度在18日齡之后顯著高于對照組;處理組中Romboutsia和Lactobacillus的豐度在多數(shù)日齡顯著小于對照組，Ruminococcaceae_UCG_005、Alistipes和Faecalibacterium的豐度在22日齡顯著小于對照組，見圖7。

2.2.3? KEGG代謝途徑差異分析? 經(jīng)與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)在第5、9和22日齡有顯著差異的代謝通路共有22個，其中3個日齡共同的有6個;第5和22日齡共同的有2個;第9和22日齡共同的有6個。攻毒后，從日齡發(fā)展上看，處理組中代謝能力（Metabolism）、外源生物降解與代謝（Xenobiotics Biodegradation and Metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、不良特征（Poorly Characterized）、其他氨基酸代謝（Metabolism of Other Amino Acids）和膜運輸（Membrane Transport）水平升高，且后期顯著高于對照組（P<0.05）;處理組中折疊、分類和降解（Folding， Sorting and Degradation）、細胞過程和信號（Cellular Processes and Signaling）、輔助因子和維生素的代謝（Metabolism of Cofactors and Vitamins）、氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）和脂質代謝（Lipid Metabolism）水平下降，且后期顯著低于對照組（P<0.05）。有6條代謝通路在第22日齡時第一次出現(xiàn)，其中信號轉導（Signal Transduction）在處理組顯著高于對照組（P<0.01）;酶家族（Enzyme Families）、聚糖生物合成與代謝（Glycan Biosynthesis and Metabolism）、核苷酸代謝（Nucleotide Metabolism）、翻譯（Translation）、復制和修復（Replication and Repair）在處理組顯著低于對照組（P<0.05），見圖8。

3? 討論

16S rRNA基因高通量測序分析得出兩組雞糞便菌群豐富度和多樣性都隨著日齡的增加而增加，與已報道的結果一致[2]，且糞便菌群的豐富度在相同日齡沒有顯著差異，但處理組的菌群多樣性在9～18日齡顯著高于對照組，說明攻毒導致了SPF雞糞便菌群多樣性增加[6]，這或許與處理組SPF雞對抗腸炎沙門氏菌的入侵相關。在22日齡時，對照組糞便菌群穩(wěn)定性均高于處理組，說明攻毒導致了SPF雞糞便菌群穩(wěn)定性變差。同時處理組多樣性的增加也表明了多樣性不能成為腸道菌群好壞的判定標準[7]。兩組菌群的β多樣性分析使用了基于Brays-Curtis算法的PCoA，5個日齡中處理組與對照組的糞便菌群OTU明顯分開。總體的樣本分布表明，隨著時間的推移，兩組的菌群結構愈加接近，攻毒對SPF雞的糞便菌群結構的影響隨時間推移逐漸變?nèi)酢?/p>

兩組雞糞便菌群在門水平（相對豐度>1%）組成一致，都由Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria組成[8];其中Firmicutes始終為最豐富的菌門[9]。第18和22日齡，Bacteroidetes的相對豐度急劇攀升，且處理組中Bacteroidetes的相對豐度顯著高于對照組（P<0.01）?？傮w來看，F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes是兩組SPF雞糞便菌群中比重最大的菌門[9]，攻毒使處理組的菌門波動比對照組更明顯。

腸炎沙門氏菌入侵后會劫持宿主吞噬體系統(tǒng)，為避免被宿主清除而形成含沙門氏菌液泡（Salmonella-containing vacuoles，SCVs），并從其中招募膜和蛋白質。SCV通過與胞吞和循環(huán)途徑的持續(xù)相互作用而成熟，從成熟的SCV延伸出來的廣泛的管膜網(wǎng)絡，促進了宿主細胞信號、膜運輸和一些蛋白質的生成[10]。

在第18日齡之后，Bacteroides在處理組的相對豐度顯著高于對照組（P<0.01），它具有增強雞新陳代謝的能力，分解難消化碳水化合物（包括纖維素和淀粉）促進碳水化合物代謝，合成丙酸[11-13]。丙酸對沙門氏菌具有抑制作用[14]。處理組中Enterococcus在9日齡之后均保持在較高的豐度水平，它作為一種重要的家禽病原體，可以通過產(chǎn)生細胞外超氧化物和過氧化氫來損傷結腸上皮細胞中的真核細胞DNA[15]，引起的局部細胞損傷和活性氧可能改變腸道通透性，導致細胞死亡，從而觸發(fā)炎癥和肥胖等不良表征[16]。處理組中外源生物降解與代謝的增強應該是由腸炎沙門氏菌攻毒引起的，這或許可以作為動物狀態(tài)異常的標志。

在18日齡之前，Lactobacillus的相對豐度在兩組中一直處于很高的水平（兩組相對豐度均大于0.5）;第22日齡時，處理組Lactobacillus的相對豐度顯著低于對照組（P<0.01）。Lactobacillus可合成乳酸來調節(jié)腸道pH值，可發(fā)酵低聚糖（低聚果糖和低聚葡萄糖）、多糖（菊粉），促進聚糖生物合成與代謝，刺激產(chǎn)丁酸鹽的細菌生長[17-19]。第22日齡時，Ruminococcaceae_UCG-005、Alistipes和Faecalibacterium在處理組中的相對豐度顯著低于對照組（P<0.01）。Ruminococcaceae_UCG-005在消化多糖和纖維方面起著重要作用[20]。

Ruminococcaceae被認為是潛在的有益菌，具有抗炎活性，參與了腸道環(huán)境的正向調節(jié)，并與免疫調節(jié)和健康的動態(tài)平衡有關[21]。Lactobacillus和Alistipes都可以將色氨酸代謝成吲哚[22， 23]，吲哚的存在降低體內(nèi)沙門氏菌侵襲，可與短鏈脂肪酸（丙酸、丁酸）的協(xié)同增強抗沙門氏菌的作用，降低沙門氏菌毒力基因（SPI-1）表達，增強上皮細胞對沙門氏菌侵襲的抵抗力[24]，吲哚可減輕宿主細胞炎癥并增加腸上皮細胞屏障的完整性[25]。Faecalibacterium屬是一種功能高度活躍的有益菌，它消耗醋酸和產(chǎn)生大量的丁酸，Sokol等人在人體外細胞模型和小鼠體內(nèi)結腸炎模型中發(fā)現(xiàn)Faecalibacterium均具有不依賴丁酸額外的抗炎特性[26]。因此Faecalibacterium對腸道穩(wěn)態(tài)至關重要，在促進腸道健康方面具有潛在的重要作用。丁酸鹽可以提高脂肪利用率，增強脂肪代謝[27]，減少沙門氏菌感染[28]，并能刺激上皮細胞生長[29]。第9日齡后，Romboutsia在對照組的相對豐度顯著高于處理組（P<0.01）。Romboutsia可利用來自宿主的L-巖藻糖[30]，而宿主能夠調節(jié)其腸道上皮細胞的巖藻糖基化反應，以巖藻糖為能源的微生物可能有助于保護宿主免受內(nèi)源性病原體的感染[31]。雖然目前沒有充分的功能性研究證明Romboutsia可以促進宿主健康，但它依然具有成為益生菌的潛力。

健康的微生物區(qū)系對于宿主消化道有著重要作用，如：產(chǎn)生各種酶，促進消化道發(fā)育和腸粘膜增殖，維生素合成和利用，發(fā)酵和內(nèi)源產(chǎn)品的利用等[32]。處理組的糞便菌群中脂質代謝、聚糖生物合成與代謝、酶家族、細胞過程和信號、氨基酸代謝、折疊、分類和降解、輔助因子和維生素的代謝、遺傳信息處理、核苷酸代謝、翻譯、復制與修復等代謝水平降低，可能是因為腸炎沙門氏菌的入侵損傷了菌群結構的結果。以上這些代謝通路的變化可在一定程度上解釋腸炎沙門氏菌入侵與糞便微生物相對豐度的變化相關關系。

4? 結論

隨著日齡的推移，糞便菌群的豐富度與多樣性增加的同時也變得更加穩(wěn)定。腸炎沙門氏菌感染影響了SPF雞早期糞便菌群的結構組成、穩(wěn)定性以及菌群參與的代謝通路，處理組中占優(yōu)的Bacteroides以及對照組占優(yōu)的Lactobacillus、Alistipes、Faecalibacterium和Ruminococcaceae_UCG_005等有益菌可能對SPF雞抵抗沙門氏菌入侵起到積極作用。未來需要進一步深入研究這些顯著變化的差異菌在調控腸道菌群中的具體作用及機制，為將來臨床開發(fā)利用某種益生菌來改善動物表現(xiàn)奠定基礎。

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