劉琦 林峰

(上海市第八人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200235)

乏氧是一種細(xì)胞供氧不足的狀態(tài)，發(fā)生在各種組織損傷中，包括缺血再灌注損傷、肺損傷、輻射誘導(dǎo)的正常組織損傷[1]。有研究報(bào)道，放射性后組織乏氧可加重放射性直腸損傷的發(fā)生[2]。乏氧可誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損傷[3]。此外，ROS可激活氧化還原信號通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)組織炎癥和加重組織損傷[4]。然而，乏氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的確切機(jī)制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性、短的、非編碼的RNA，能夠結(jié)合靶基因mRNAs的3′-UTR，通過mRNA降解或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)[5]。有研究[6]表明miRNA-210可以通過下調(diào)乏氧條件下Bcl-2的表達(dá)降低結(jié)腸癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究探討乏氧條件下miR-210對成纖維細(xì)胞存活的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料

1.1.1細(xì)胞系和培養(yǎng)條件 將人類皮膚成纖維細(xì)胞GM0639細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle′s培養(yǎng)基(法國Biowest)中培養(yǎng)。在三氣培養(yǎng)箱(YCP-50S，長沙華西電子技術(shù)有限公司，中國)中于37°C，5%CO2，93%N2和2%O2的條件下進(jìn)行乏氧處理。

1.1.2RNA分離和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(RNAprep Pure Cell/細(xì)菌試劑盒，天根，北京，中國)分離總RNA。miR-210逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTC AGCC-3′。所使用的實(shí)時(shí)PCR引物序列如下：miR-210 5′-CTGTGCGTGTGACAG-3′和miR-210反義序列，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6反義序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; HIF-1α 5′-CGTTCCTTCGATCAGTTGTC-3′和HIF-1α反義序列，5′-TCAGTGGTGGCAGTGGTAGT-3′;BDNF5′-GAGCTGAGCGTGTGTGACAG-3′和BDNF反義序列5′-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3′。

1.1.3Western blot 用Pierce BCA蛋白測定試劑盒(ThermoFisher，MA，USA)進(jìn)行蛋白濃度定量。通過在10%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)提取物，然后轉(zhuǎn)移到BioTraceNC膜(美國紐約州Pall)上。用封閉緩沖液(5%(w/v)牛血清白蛋白，0.1%(w/v)Tween 20磷酸鹽緩沖液)封閉1 h。用于western blot的抗體如下：抗HIF-1α(Epitomics，CA，美國)，NF-κB/p-NF-κBp65(Epitomics)，抗LC3(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.(日本)和抗BDNF(英國Abcam)，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗抗兔抗體(Millipore，MA，美國)或抗小鼠抗體(Genetex，TX，USA)。使用ECL印跡檢測試劑(ThermoFisher)檢測，并使用Chemioscope Mini系統(tǒng)(ChemiQ 4800 Bioshine，中國)進(jìn)行成像。

1.2檢測方法

1.2.1凋亡檢測 PBS洗滌細(xì)胞兩次，在37℃下離心5 min，并重懸于結(jié)合緩沖液中。然后，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，NJ，美國)和碘化丙錠(BD Bioscience)對細(xì)胞染色。然后使用流式細(xì)胞儀(FC500 MPL，貝克曼庫爾特，CA，美國)分析染色的細(xì)胞。

1.2.2ROS生成測定 將細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)24 h和48 h，然后與2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(20 mM)(DCF-DA； Beyotime Biotechnology，中國)在黑暗中孵育20 min。然后，將細(xì)胞懸液在室溫下離心5 min，并除去上清液。使用流式細(xì)胞儀(FC500 MPL，Beckman Coulter)測量和計(jì)算DCF-DA的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行ROS檢測。

1.2.3自噬檢測 用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后在37℃下離心5 min，并重懸于結(jié)合緩沖液中。使用Cyto-ID自噬檢測試劑盒(美國，恩佐)對自噬體進(jìn)行了染色。使用熒光顯微鏡(Eclipse Ti-S，Nikon，Japan)對細(xì)胞照相，并使用流式細(xì)胞儀(FC500 MPL，Beckman Coulter)檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染 siRNA序列的合成(上?；蛑扑幱邢薰荆袊?如下：miR-210 siRNA，5′-UCAGCCGCUGUCACACGCACAG-3′；HIF-1αsiRNA正義，5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3′和HIF-1α反義，5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，BDNF siRNA正義，5′-GAGCGUGUGUGUGACAGUAUUTT-3′和BDNF反義，5′-AAUACUGUCACACAC′。將細(xì)胞鋪板24 h，然后使用X-tremeGene siRNA試劑(Roche)將miR-210 siRNA，HIF-1αsiRNA或BDNF siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG水平檢測 將細(xì)胞在6孔板中鋪板24 h，將細(xì)胞用冷PBS洗滌一次。使用GSH和GSSG測定試劑盒(中國Beyotime)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG水平檢測。

2 結(jié) 果

2.1乏氧對細(xì)胞凋亡，ROS產(chǎn)生和自噬的影響 與正常氧條件下(21%O2)相比，乏氧處理(2%O2)下的細(xì)胞凋亡(圖1A)，ROS產(chǎn)生(圖1B)和自噬體形成(圖1C，1D)顯著增加。這些作用是時(shí)間依賴性的。

圖1 乏氧對細(xì)胞凋亡、ROS生成及自噬的影響

2.2乏氧處理下HIF-1α和miR-210的表達(dá) 與正常氧條件下相比，乏氧處理超過12 h后，HIF-1α和miR-210顯著增加(圖2A-C)。在乏氧下，用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后，miR-210的表達(dá)顯著降低(圖2D，E)。這些提示miR-210是HIF-1α的下游靶標(biāo)。

圖2 乏氧條件下HIF-1α與miR-210的關(guān)系

2.3miR-210對ROS產(chǎn)生，細(xì)胞凋亡和GSH/GSSG水平的影響 在乏氧條件下，與對照組細(xì)胞相比，miR-210干擾后表達(dá)水平降低的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和ROS水平顯著增加(圖3A-C)。此外，在乏氧條件下，miR-210的干擾可顯著降低GSH / GSSG水平(圖3D)。

圖3 乏氧條件下miR-210對ROS生成、GSH/GSSG和細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-210，BDNF，NF-κB與自噬之間的關(guān)系 miR-210與BDNF的3′UTR內(nèi)的高度保守序列結(jié)合(圖4A)。 在miR-210受到siRNA干擾后，BDNF mRNA和蛋白表達(dá)均增加(圖4B，4C)。此外，p-NF-κB p65隨著BDNF的干擾而增加(圖4D)。當(dāng)BAY11-7082(10μM，24 h)抑制p-NF-κBp65時(shí)，LC3-II和LC3-I的比例從3.2降低到1.9(圖4E)。提示miR-210可能通過BDNF /NF-κB途徑影響自噬。

圖4 miR-210、BDNF、NF-κB與自噬的關(guān)系

3 討 論

乏氧的發(fā)生會導(dǎo)致許多病理狀況產(chǎn)生,它會對細(xì)胞和組織的生物學(xué)功能產(chǎn)生不利影響，傷口和組織重塑會導(dǎo)致脈管系統(tǒng)的破壞和受損組織內(nèi)氧氣的供應(yīng)減少，進(jìn)而引起乏氧狀態(tài)[7]。研究證實(shí)乏氧是加重缺血再灌注[8]，中風(fēng)[9]和放射[10]引起的組織損傷的誘導(dǎo)劑。乏氧會導(dǎo)致ROS水平的升高，包括過氧化物，超氧化物，羥基自由基等，這些都是由NADPH氧化酶和黃嘌呤氧化酶調(diào)節(jié)的[11]。研究發(fā)現(xiàn)乏氧下HIF-1α表達(dá)增加，隨后刺激ROS形成, ROS形成的增加促進(jìn)FoxO3a的活性，然后通過增加Bim和Bax并降低Bcl-xL和Bcl-2來誘導(dǎo)凋亡[12]。已發(fā)現(xiàn)MiRNA與多種生物學(xué)過程有關(guān)，包括細(xì)胞增殖，分化，凋亡和血管生成[13]。既往研究表明，包括miR-210在內(nèi)的幾種miRNA對乏氧都有反應(yīng)。既往研究已證實(shí)miR-210在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷中起作用[14]。 miR-210過表達(dá)誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生與凋亡有關(guān)。在癌癥中，已證明miR-210在神經(jīng)母細(xì)胞瘤，肺腺癌，腎細(xì)胞癌，食管鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中以促凋亡的方式起作用[15]。

BDNF可以通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)來保護(hù)心臟，并通過募集內(nèi)皮細(xì)胞來促進(jìn)缺血組織的新生血管形成[16]。BDNF可以結(jié)合原肌球蛋白相關(guān)的激酶B(TrkB)。 BDNF-TrkB的結(jié)合促進(jìn)了促分裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ ERK)，磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的激活[17]。進(jìn)一步的研究表明，BDNF /原肌球蛋白相關(guān)激酶B(TrkB)通路通過增加Bcl-2表達(dá)并抑制caspase-3活性，進(jìn)而具有抗缺血凋亡的作用[18]。已知有幾種miRNA會影響B(tài)DNF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制，包括miR-16，miR-22，miR-195和miR-210[19]。研究已發(fā)現(xiàn)miR-210通過靶向BDNF來調(diào)節(jié)局部麻醉誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)毒性和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)毒性。此外，BDNF抑制作用可以逆轉(zhuǎn)miR-210下調(diào)對布比卡因誘發(fā)的DRG神經(jīng)毒性的保護(hù)作用[20]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-210是HIF-1α的下游靶標(biāo)，并且在乏氧條件下被上調(diào)，這與既往研究一致。在成纖維細(xì)胞中，miR-210的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致BDNF表達(dá)升高。

核因子(B(NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，已有研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)與先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，應(yīng)激，細(xì)胞存活，細(xì)胞增殖和細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的表達(dá)中起著核心作用。 NF-κB是五個(gè)亞基的二聚體，如RelA(p65)，RelB，c-Rel，NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，其中最豐富且普遍存在的是p50-p65異二聚體。通過與IκB抑制蛋白的成員相互作用，它以潛在形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。 NF-κB可以通過破壞與IκB的相互作用激活。釋放的NF-κB易位至細(xì)胞核，然后與靶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的κB元素結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)受抑制[21]。研究表明，BDNF也可以激活NF-κB。另外，BDNF可以通過抑制海馬神經(jīng)元中的NF-κB信號傳導(dǎo)來刺激白介素-1β(IL-1β)[22]。這些提示NF-κB是BDNF和自噬之間的一種可能的介質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，BDNF下調(diào)會增加p-NF-κBp65的表達(dá)，而p-NF-κB受抑制會導(dǎo)致自噬水平降低。這些表明NF-κBp65的表達(dá)可能與BDNF和自噬密切相關(guān)。

綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)乏氧/HIF/miR-210在乏氧條件下的細(xì)胞存活中起著重要作用。miR-210影響細(xì)胞存活的機(jī)制與BDNF/NF-κB/自噬信號通路密切相關(guān)。它可能為乏氧相關(guān)的組織損傷提供潛在的治療方法。