張紀(jì)偉，沈雪梅，張釬，周藝凡，李光秀，李家華*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201；3.鹽津縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 昭通 657500）

普洱茶是我國云南地區(qū)特有的歷史傳統(tǒng)名茶，以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種茶樹的曬青毛茶為原料，采用特定加工工藝制成的具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉，并分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）兩種類型[1]。有學(xué)者通過蒸餾萃?。╯imultaneous distillationextraction，SDE）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[2]、感官審評(píng)和SDEGC-MS結(jié)合[3]、感官審評(píng)和化學(xué)成分分析結(jié)合[4]、電子鼻法[5]和GC-MS法[6]研究普洱茶儲(chǔ)藏時(shí)間、儲(chǔ)藏環(huán)境、品質(zhì)風(fēng)味，發(fā)現(xiàn)貯存時(shí)間是形成普洱茶香氣和滋味品質(zhì)的重要步驟，在適當(dāng)?shù)馁A存條件下普洱茶越陳越香、相同級(jí)別的普洱茶儲(chǔ)藏時(shí)間與品質(zhì)呈現(xiàn)正相關(guān)。茶葉中的呈味物質(zhì)主要是溶于熱水的水浸出物，大量研究表明茶湯滋味主要是由茶多酚（澀味）、咖啡堿（苦味）和氨基酸（鮮味）產(chǎn)生，茶多酚中對(duì)茶湯苦澀味影響最大的是4種表型兒茶素，而黃酮醇類物質(zhì)也會(huì)影響茶湯的苦味[7-9]。視覺模擬強(qiáng)度尺度評(píng)價(jià)滋味強(qiáng)度研究中發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）主要變化為澀、苦味；電子鼻電子舌結(jié)合對(duì)茶葉品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性氣體含量受到呈味物質(zhì)的影響[10-11]。高力等[12]研究不同年份兒茶素含量及組成發(fā)現(xiàn)其含量隨著貯存年份的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，兒茶素在味感上表現(xiàn)為苦澀味，其中澀味較重的是收斂性較強(qiáng)的酯型兒茶素，而苦味較重的是非酯型兒茶素[13-14]。

普洱茶是活的有機(jī)體，非常有必要揭示其香氣成分和影響茶湯滋味物質(zhì)在貯存過程中的變化規(guī)律。但是由于產(chǎn)地不同，即使是相同年份的普洱茶其香氣和滋味都會(huì)產(chǎn)生各自的風(fēng)味特點(diǎn)，因此，如何從呈味物質(zhì)和香氣物質(zhì)的角度去解釋普洱茶的地域特色，進(jìn)而理順普洱茶市場(chǎng)就顯得尤為重要。鑒于此，本研究以產(chǎn)自西雙版納、臨滄和德宏3個(gè)茶區(qū)的2009、2011、2013、2015和2017年的普洱生茶為試驗(yàn)材料，對(duì)不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶的揮發(fā)性香氣特征物質(zhì)和滋味物質(zhì)茶多酚、兒茶素組分、咖啡堿和氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并采用主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）分析對(duì)年份和產(chǎn)地鑒別開展了研究。研究結(jié)果明確了普洱生茶香氣對(duì)年份鑒定的作用和滋味物質(zhì)隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生化學(xué)變化的規(guī)律，為普洱茶的科學(xué)貯存和地域特色的研究提供參考與借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 茶樣

2009、2011、2013、2015 和 2017 年分別生產(chǎn)和貯存于西雙版納（XSBN）茶區(qū)、臨滄（LC）茶區(qū)和德宏（DH）茶區(qū)的普洱茶生茶，具體茶樣明細(xì)見表1。

表1 供試茶樣明細(xì)表Table 1 List of tea samples tested

1.1.2 試劑

氯化亞錫（SnCl2·2H2O）、茚三酮、酒石酸鉀鈉（C4H4KNaO6-4H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·7H2O）、硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O），以上均為分析純：市售；試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品[兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素（catechin，GC）、咖啡堿（caffeine，CAF）（HPLC≥99%）]：上海源葉生物科技有限公司；珍茗金龍純凈水（規(guī)格：18.9 L）：昆明珍茗食品有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X-5紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；1200高效液相色譜系統(tǒng)：[UV檢測(cè)器（1200VWDG1314B）、柱溫箱（1100/1200G1316A）、溫控自動(dòng)進(jìn)樣器（1100/1200G1329A）；脫氣機(jī)（1100/1200G1322A）、溶劑輸送泵（1100/1200四元泵 G1311A）]：美國 Agilent公司；TSK gel ODS-80TM 色譜柱（4.6 mmΦ×250 mm，5 μm）：日本Tosoh公司；PEN3電子鼻：德國Airsence公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻測(cè)定香氣成分

用電子鼻傳感器陣列對(duì)茶湯香氣進(jìn)行采集和分析，10個(gè)金屬氧化物氣敏傳感器性能如表2。檢測(cè)過程中的響應(yīng)信號(hào)為傳感器陣列接觸揮發(fā)性氣體后的電導(dǎo)率G與經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)凈化裝置處理后的電導(dǎo)率G0的比值，即G/G0的變化代表了香氣物質(zhì)含量的相對(duì)變化，準(zhǔn)取稱取待測(cè)茶樣各1.000 g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL的沸水，迅速蓋上保鮮膜密封，靜置冷卻至45℃，搖勻后進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定條件：儀器預(yù)熱（30 min），清洗傳感器（120 s）至各傳感器響應(yīng)值趨向于1.000 0，檢測(cè)樣品（流速300 mL/min，信號(hào)采集60 s），記錄對(duì)應(yīng)的特征響應(yīng)值。

表2 傳感器性能及對(duì)應(yīng)香氣類型Table 2 Sensor performance and corresponding aroma types

1.3.2 滋味物質(zhì)含量測(cè)定

按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》，GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，兒茶素和咖啡堿含量采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定，參照王瑋等[15]的方法。色譜條件：0.261%磷酸-5%乙腈的流動(dòng)性A相、0.261%磷酸-80%乙腈的流動(dòng)性B相；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；結(jié)束時(shí)間28 min；平衡時(shí)間6 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

由于各傳感器在55 s后響應(yīng)值比較平穩(wěn)，使用電子鼻自帶的Winmuster軟件分別對(duì)茶湯香氣成分56 s～58 s的響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析（PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和傳感器區(qū)分貢獻(xiàn)率（Loadings）分析；SPSS18進(jìn)行顯著性分析，兒茶素苦澀味指數(shù)根據(jù)施兆鵬等[16]推導(dǎo)出的Y（兒茶素苦澀味指數(shù)）=[（-）-EGCG含量+（-）-EGC含量+（-）-ECG含量+（±）-GC含量]/[（±）-C含量+（-）-EC含量]計(jì)算，PLS-DA采用SIMGA14.1進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地及貯存年份普洱生茶電子鼻香氣測(cè)定

不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶供試樣PCA（A）、LDA（B）、Loadings（C）分析見圖 1。

圖1 不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶供試樣PCA、LDA、Loadings分析圖Fig.1 Analysis chart of PCA，LDA and loading of raw Pu-erh tea samples from different regions and storage years

供試茶樣PCA結(jié)果如圖1A所示，第一主成分貢獻(xiàn)率為97.45%，第二主成分貢獻(xiàn)率為1.95%，兩個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.40%，前兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率越大，越能更多反映樣品的主要信息特征，說明此PCA對(duì)不同產(chǎn)地和貯存年份普洱生茶香氣的區(qū)分度較高，且從PCA圖中可以看出雖然部分供試樣有相交部分，但產(chǎn)地和年份的區(qū)分度較好。LDA結(jié)果如圖1B所示，表明供試茶樣在貯存期間香氣物質(zhì)發(fā)生了變化，其中德宏2009年和2015年有部分重疊且西雙版納2009年和雙江2013年有部分重疊，其余供試樣都分布在不同區(qū)域，說明產(chǎn)地和貯存年份相對(duì)接近的茶樣內(nèi)含的揮發(fā)性成分含量和種類也比較接近，通過電子鼻可以判別區(qū)分。Loadings分析結(jié)果如圖1C所示，在區(qū)分不同貯存年份茶樣揮發(fā)性物質(zhì)變化中，W1W（敏感性成分：硫化物）傳感器在第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大，其次W2W（敏感性成分：芳香成分和有機(jī)硫化物）傳感器；W1S（敏感性成分：甲烷）傳感器在第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大，其次是W2S（敏感性成分：乙醇）傳感器，說明甲烷和硫化物兩類氣體在區(qū)分茶樣時(shí)起主要作用，其次是芳香成分和有機(jī)硫化物及乙醇。

2.2 不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶呈味物質(zhì)測(cè)定

普洱生茶加工工藝中沒有渥堆這一工序，因此其口感的變化完全依賴于后期自然貯存條件下茶葉內(nèi)部發(fā)生的變化，口感的變化是由一系列生化成分的動(dòng)態(tài)變化而引起的，如苦澀味逐漸減弱、醇和度的提升、刺激性的下降等。本試驗(yàn)測(cè)定的茶多酚、咖啡堿、氨基酸、兒茶素總量和酚氨比及兒茶素苦澀味指數(shù)Y的變化如表3所示。

表3 不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶各組分含量及相關(guān)系數(shù)Table 3 Contents and correlation coefficients of each component in raw Pu-erh tea from different regions and storage years

由表3可知，各組分含量在貯存期前后發(fā)生顯著的變化（P<0.05）：咖啡堿是茶葉重要的滋味物質(zhì)，具有苦味且閾值很低[17]，與茶湯滋味有很大的關(guān)系，由于咖啡堿本身具有較穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，其含量隨著貯存期的變化相對(duì)于其它三類物質(zhì)并不明顯；氨基酸能夠參與普洱茶陳化過程中兒茶素的氧化反應(yīng)并影響茶湯的鮮爽味，其含量變化在3個(gè)產(chǎn)區(qū)都較顯著；茶多酚含量在各個(gè)產(chǎn)地貯存前期間呈曲線變化，最終都隨著貯存年份延長(zhǎng)表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)；各兒茶素組分在3個(gè)產(chǎn)區(qū)的變化都是隨著貯存年份的延長(zhǎng)，含量出現(xiàn)明顯的下降，EGCG的含量在所有兒茶素組分中最高，且含量下降最顯著，普洱生茶的苦澀味受到酯型兒茶素的影響，不同貯存年份茶樣兒茶素含量也是酯型兒茶素比非酯型兒茶素高出許多，在貯存過程中酯型兒茶素會(huì)發(fā)生水解，降低茶湯的苦澀味，這可能是普洱生茶貯存時(shí)間越久，口感變得越醇滑的原因之一；兒茶素苦澀味指數(shù)Y在3個(gè)產(chǎn)地都是貯存時(shí)間最短的數(shù)值最大，說明茶湯的苦澀味隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)整體上呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，在貯存期間苦澀味變化最大的是西雙版納產(chǎn)區(qū)。

2.3 供試樣香氣和呈味物質(zhì)分析

基于香氣和呈味物質(zhì)的測(cè)定數(shù)據(jù)，構(gòu)建不同產(chǎn)地不同貯存年份的普洱生茶PLS-DA得分圖見圖2。擬合模型的RX2=0.879，RX2越接近1，此模型越穩(wěn)定；RY2=0.936，RY2越大,模型的解釋能力越強(qiáng)，說明該模型可以解釋93.6%的原始數(shù)據(jù)；Q2=0.597，Q2大于0.5，表明此模型預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。

圖2 不同產(chǎn)地及不同貯存年份普洱生茶香氣和呈味物質(zhì)分析Fig.2 Analysis of aroma and flavor components of raw Pu-erh tea from different regions and storage years

如圖2所示可以明顯地將15個(gè)供試樣分為3部分，表明不同產(chǎn)地不同貯存年份供試茶樣主要香氣和呈味物質(zhì)間存在差異顯著，說明不同茶產(chǎn)區(qū)的普洱生茶香氣和呈味物質(zhì)隨著貯存地點(diǎn)的變化表現(xiàn)出地域的特點(diǎn)。西雙版納產(chǎn)區(qū)的供試樣全部位于X負(fù)半軸，德宏產(chǎn)區(qū)和臨滄產(chǎn)區(qū)除德宏2015年的供試樣外其余位于X正半軸，西雙版納產(chǎn)區(qū)不同貯存年份供試樣的坐標(biāo)點(diǎn)在得分圖上的位置更遠(yuǎn)，其次是德宏產(chǎn)區(qū)，表明西雙版納茶區(qū)存放的供試樣貯存年份之間的變化程度更大，三地普洱生茶的香氣和呈味物質(zhì)在地區(qū)之間的差異為西雙版納產(chǎn)區(qū)>德宏產(chǎn)區(qū)>臨滄產(chǎn)區(qū)。德宏產(chǎn)區(qū)和臨滄產(chǎn)區(qū)供試樣在得分圖中距離較近，表現(xiàn)與三地在云南的地理位置分布相似，說明盡管是在同一個(gè)大范圍，但不同產(chǎn)地供試樣貯存適當(dāng)時(shí)間之后會(huì)表現(xiàn)出地域的特點(diǎn)，各個(gè)產(chǎn)地之間滋味和香氣受到貯存環(huán)境的影響出現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)化。

3 討論

茶葉品質(zhì)的好壞受到香氣和滋味的影響，普洱生茶在貯存過程中受到環(huán)境和時(shí)間的影響，較重的苦澀味會(huì)逐漸減輕使口感變得醇滑甜潤(rùn)，香氣從新鮮刺激的清香變?yōu)檩^為低沉的香型[18]，香氣和滋味在緊壓茶各項(xiàng)審評(píng)因子中占30%和35%[19]。普洱生茶在自然條件下貯存，不僅有曬青毛茶的香氣和后期貯存過程中形成的陳香，而且還含有自身內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的特殊香氣，是一個(gè)緩慢的陳化過程[20]。諶瑩等[21]研究表明隨著陳化年份的延長(zhǎng)，普洱生茶香氣由花香轉(zhuǎn)化為陳香、滋味的收斂性和粗澀感都逐步減弱。本文研究表明電子鼻對(duì)不同產(chǎn)地和貯存年限份洱生茶的區(qū)分度較強(qiáng)，這一點(diǎn)與陳婷等[22]通過電子鼻對(duì)普洱熟茶品質(zhì)判別結(jié)果基本一致，羅美玲、高林、張曉云等[23-25]也利用電子鼻對(duì)不同年份、不同品質(zhì)以及不同處理普洱茶的香氣物質(zhì)進(jìn)行了研究。在研究茶湯滋味方面，從選取供試樣的兒茶素苦澀味指數(shù)的變化情況來看，說明隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)苦澀味呈下降的趨勢(shì)，與前人的研究結(jié)果相同：Zhang等[26]研究表明EGCG和EGC、EC兩兩混合后會(huì)使茶湯苦澀味增強(qiáng)，且EGCG可減弱EGC和EC的回甘，說明兒茶素組分之間的互作會(huì)影響茶湯的苦澀味，施兆鵬等[16]認(rèn)為酯型兒茶素增加、非酯型兒茶素降低是導(dǎo)致茶湯苦澀的重要因素，田學(xué)鳳[27]對(duì)普洱生茶陳化技術(shù)的研究也表明貯藏時(shí)間直接影響普洱生茶的感官品質(zhì)，茶湯的澀味會(huì)減弱。氨基酸常被用來作為判斷茶湯滋味鮮爽度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，其數(shù)值越大，說明茶湯滋味得分越高[28]。寧井銘等[29]通過研究貯存在新疆和廣東5個(gè)不同貯存年份的普洱生茶，證實(shí)貯存環(huán)境的不同會(huì)使茶葉內(nèi)含品質(zhì)發(fā)生明顯差異，不同區(qū)域的變化情況不同，本試驗(yàn)選取的3個(gè)區(qū)域也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。但是薛晨等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)在一定的貯存范圍內(nèi)，原料級(jí)別對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響大于貯存時(shí)間的影響，電子鼻檢測(cè)的傳感器局限于只能檢測(cè)到的10種物質(zhì)，因此測(cè)定的結(jié)果存在一定范圍內(nèi)的誤差，而且供試茶樣的選擇也只在云南地區(qū)，在后面的研究中，應(yīng)結(jié)合原料、加工和貯存條件的實(shí)際情況共同探索普洱生茶品質(zhì)在貯存期內(nèi)的變化情況，使其品質(zhì)達(dá)到最佳。

4 結(jié)論

3個(gè)產(chǎn)地普洱生茶供試樣的香氣物質(zhì)變化顯著，通過香氣物質(zhì)的變化可以顯著區(qū)分產(chǎn)地和貯存年份，電子鼻PCA模型的分類效果最好，起主要區(qū)分作用的香氣物質(zhì)是甲烷和硫化物這兩類氣體。主要呈味物質(zhì)含量在3個(gè)產(chǎn)地都是隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，且貯存時(shí)間越長(zhǎng)的供試樣苦澀味指數(shù)越小，說明貯存的環(huán)境和年份都對(duì)普洱生茶香氣和滋味產(chǎn)生較大影響。PLS-DA分析結(jié)果表明產(chǎn)地和貯存年份之間區(qū)分度顯著，通過呈味物質(zhì)和香氣之間的差異可以區(qū)分產(chǎn)地和貯存年份，且3個(gè)產(chǎn)地間貯存年份差異顯著，依次是西雙版納>德宏>臨滄，說明貯存在西雙版納產(chǎn)區(qū)的供試樣物質(zhì)間轉(zhuǎn)化更明顯，為后期研究相關(guān)內(nèi)容提供一些借鑒。