李慶，閆曉劍，黃永亮，彭善貴，趙小勤，周曉英，羅霄，文永盛

1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610045；2.國家藥品監(jiān)督管理局 中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；4.成都虹微技術(shù)有限公司，四川 成都 610041

西紅花為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2005—2015年版西紅花檢查項(xiàng)下均有吸光度值測(cè)定方法[1-3]。筆者對(duì)存儲(chǔ)于成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院Laboratory Information Management System內(nèi)近5年已發(fā)布的34份西紅花檢品和現(xiàn)有文獻(xiàn)中西紅花樣品按《中國藥典》方法測(cè)定吸光度值的數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計(jì)[4-6]，發(fā)現(xiàn)86%的西紅花樣品吸光度值超出《中國藥典》2015年版規(guī)定的紫外分光光度法檢測(cè)的合理范圍(0.3～0.7)。同時(shí)，對(duì)本課題隨機(jī)采集的107份國產(chǎn)及伊朗產(chǎn)西紅花樣品采用該法測(cè)試，同樣發(fā)現(xiàn)有72%的樣品吸光度值不在0.3～0.7?！段骷t花等級(jí)質(zhì)量》[6]和《中國藥典》2015年版中均指明，西紅花含量測(cè)定應(yīng)避光操作，而西紅花吸光度值測(cè)定法未對(duì)操作條件作規(guī)定。

當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)中主要采用較為耗時(shí)的液相色譜法測(cè)定單個(gè)或數(shù)個(gè)有效成分作為西紅花主要質(zhì)量控制指標(biāo)[3，7-10]，但中藥功效是復(fù)雜成分協(xié)同作用的結(jié)果。西紅花吸光度值的測(cè)定波長為432 nm，該吸光度值與西紅花苷類成分含量呈正比。與單個(gè)或數(shù)個(gè)有效成分相比，吸光度值更能整體反映西紅花品質(zhì)，同時(shí)紫外分光光度法測(cè)定速度快、成本低。因此，本研究對(duì)西紅花吸光度值測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)研究，并對(duì)不同產(chǎn)地、不同等級(jí)的西紅花品質(zhì)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，為西紅花質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制方法的制定提供參考。

1 材料

1.1 試藥

收集伊朗及我國上海、浙江、河南、安徽產(chǎn)的西紅花樣品107份，其中伊朗70份，國產(chǎn)37份，見表1。樣品經(jīng)成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院文永盛主任藥師鑒定為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭；對(duì)照品西紅花苷Ⅰ(批號(hào)：BP0406)、西紅花苷Ⅱ(批號(hào)：BP0407)購自成都普非德生物技術(shù)有限公司，純度均大于97.14%；甲醇為分析純。

表1 西紅花樣品信息

1.2 儀器

UV-2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；SK250H型超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

對(duì)所有西紅花樣品照《中國藥典》2015年版方法進(jìn)行粉碎，備用。

2.2 提取方法考察

隨機(jī)選取上述粉碎好的西紅花樣品1份，精密稱取30 mg，分別考察索氏提取、回流提取、超聲提取對(duì)西紅花樣品吸光度值的影響。索氏提取法按照《中國藥典》2015年版中方法，提取至索氏管中液體無色為終點(diǎn)；回流提取法選取提取時(shí)間分別為30、45、60、75、90 min；超聲提取法選取提取時(shí)間分別為30、45、60、75、90 min。上述條件下所得提取液采用紫外-可見分光光度法在432 nm下測(cè)定吸光度值。

2.3 穩(wěn)定性考察

以2.2項(xiàng)下超聲提取45 min的供試品溶液作為穩(wěn)定性考察溶液，在10和25 ℃、避光與不避光條件下，每隔1 h測(cè)試，觀察吸光度值變化情況。

2.4 稀釋倍數(shù)的確定

按上述確定好的提取方法，考察所有粉碎好的西紅花樣品，精密稱取30 mg，置相應(yīng)提取方法所需提取器中，按《中國藥典》2015年版西紅花吸光度值測(cè)定方法，測(cè)定所有西紅花樣品的吸光度值。根據(jù)吸光度值在一定范圍內(nèi)與溶液質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，計(jì)算上述樣品的最適稀釋倍數(shù)。選擇在稀釋1000、1111、1250、1429、1667、2000倍條件下，所有西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7數(shù)量最多的稀釋倍數(shù)。并按照計(jì)算的最適稀釋倍數(shù)測(cè)定樣品吸光度值。

2.5 對(duì)照品溶液配制和測(cè)定

精密稱取西紅花苷Ⅰ對(duì)照品5.591 mg、西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌?.201 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.003 35 mg·mL-1的西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為0.002 52 mg·mL-1的西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海謩e在波長270～650 nm進(jìn)行掃描，獲取紫外光譜數(shù)據(jù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SAS軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)(Shapiro-Wilk normality test)、t檢驗(yàn)(t-test)和秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon rank sum test)及變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比值)計(jì)算。

3 結(jié)果與分析

3.1 西紅花樣品提取方法考察

不同提取方法提取后樣品的吸光度檢測(cè)結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，回流提取的最佳效果不能達(dá)到索氏提取效果，而超聲45～75 min即可達(dá)到索氏提取效果，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，則提取效果下降，表明超聲提取45 min可作為改進(jìn)后的提取方法。

圖1 索氏提取、回流提取、超聲提取法提取西紅花效果比較(n=2)

3.2 西紅花樣品穩(wěn)定性考察

由表2可知，在不避光條件下，西紅花樣品在25 ℃時(shí)2 h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定(RSD<3%)，繼續(xù)增加放置時(shí)間吸光度值呈逐步下降趨勢(shì)；10 ℃時(shí)8 h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定(RSD<3%)。在避光條件下，西紅花樣品在25 ℃時(shí)4 h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定(RSD<3%)，10 ℃ 時(shí)8 h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定。結(jié)果表明，在25 ℃、不避光條件下西紅花測(cè)定應(yīng)盡快完成，而在25 ℃、避光條件下更加穩(wěn)定。低溫條件下(10 ℃)無論是避光或不避光，8 h內(nèi)測(cè)試液均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。表明西紅花吸光度值應(yīng)在避光條件下測(cè)定，并盡快完成測(cè)試。

表2 不同溫度、避光與否條件下西紅花樣品的穩(wěn)定性比較(n=2)

3.3 西紅花樣品稀釋倍數(shù)考察

按《中國藥典》2015年版方法，選取稀釋倍數(shù)為1000，結(jié)果表明，僅28%的西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7(圖2)。根據(jù)質(zhì)量濃度與吸光度值呈正比，計(jì)算得出，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1667時(shí)所有西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7的數(shù)量最多，即稀釋方法為樣品用40 mL甲醇提取后，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻，再精密量取0.6 mL置于10 mL或精密量取3 mL置于50 mL量瓶中，搖勻，濾過，即得。按該稀釋倍數(shù)測(cè)定所有西紅花樣品的吸光度值，發(fā)現(xiàn)88%的西紅花樣品吸光度值在0.3～0.7(圖3)。

圖2 稀釋倍數(shù)為1000時(shí)西紅花樣品的吸光度值分布(n=2)

圖3 稀釋倍數(shù)為1667時(shí)西紅花樣品的吸光度值分布(n=2)

改進(jìn)后的吸光度值測(cè)定方法稀釋倍數(shù)發(fā)生了改變，其限度也隨之變化，限度與代表性樣本的均值相關(guān)[11-13]，而吸光度值的大小與溶液的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，因此，按照公式(1)計(jì)算新的吸光度限度值為0.3。

限度值=原吸光度限度×原吸光度限度下稀釋倍數(shù)/新吸光度限度下稀釋倍數(shù)

(1)

由圖3可知，107個(gè)樣品中21批樣品不合格，這與原吸光度限度為0.5時(shí)的判斷結(jié)果一致(圖2)。

3.4 樣品測(cè)定結(jié)果分析

按照優(yōu)化后的方法測(cè)定107批西紅花樣品的吸光度，對(duì)所得光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。國產(chǎn)的37份西紅花樣品的吸光度值為0.225～0.716，其中僅1批樣品不符合限度要求；伊朗產(chǎn)70份西紅花樣品的吸光度值為0.075～0.603，與國產(chǎn)樣品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中有20批不合格。同時(shí)，國產(chǎn)西紅花質(zhì)量更加穩(wěn)定(變異系數(shù)為0.206)，而伊朗產(chǎn)西紅花等級(jí)差別大，整體質(zhì)量變異較大(變異系數(shù)為0.402)。樣品光譜圖見圖4A。結(jié)果表明，在本研究中，國產(chǎn)西紅花樣品質(zhì)量優(yōu)于伊朗產(chǎn)西紅花樣品，也與文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]。目前，國產(chǎn)西紅花價(jià)格2～4萬元/kg，甚至更高，而伊朗產(chǎn)西紅花價(jià)格為1萬元/kg左右。

不同級(jí)別西紅花樣品吸光度值測(cè)定圖譜見圖4B。20份特級(jí)西紅花樣品的吸光度值為0.219～0.603，有2份不合格(合格率90%)；7份一級(jí)西紅花樣品的吸光度值為0.260～0.466，有5份合格(合格率71%)；12份二級(jí)及二級(jí)以下等級(jí)的西紅花樣品吸光度值為0.098～0.327，僅4份合格(合格率33%)。數(shù)據(jù)表明，特級(jí)西紅花合格率高于一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)西紅花(P<0.05，P<0.001)，一級(jí)西紅花合格率高于二級(jí)和三級(jí)西紅花(P<0.01)。但筆者通過調(diào)查當(dāng)前市銷西紅花等級(jí)劃分方法發(fā)現(xiàn)，商家主要根據(jù)貨物的狀態(tài)和自身經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行劃分，劃分標(biāo)準(zhǔn)比較混亂，如有的商家是根據(jù)花柱的長短、色澤進(jìn)行劃分，有的則根據(jù)放置年限進(jìn)行劃分，有的還根據(jù)雜質(zhì)多少進(jìn)行劃分等。圖4B中可以看出，特級(jí)西紅花、一級(jí)西紅花、二級(jí)西紅花之間的光譜線存在一定程度的交叉，因此有必要制定統(tǒng)一的和科學(xué)合理的等級(jí)劃分方法。

注：A.不同產(chǎn)地西紅花樣品；B.不同等級(jí)西紅花樣品；C.西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ。圖4 西紅花樣品、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的紫外光譜圖

由圖4C可知，西紅花甲醇提取液、西紅花苷Ⅰ甲醇溶液和西紅花苷Ⅱ甲醇溶液均在432 nm處有最大吸收峰，在457 nm處也均有1個(gè)較大吸收峰，西紅花苷類成分具有相同的母核，其主要差異是取代基糖數(shù)量和種類不同[15]。由于缺乏足夠的西紅花苷類成分對(duì)照品，由現(xiàn)有的西紅花苷Ⅰ和Ⅱ的吸收光譜可知，其他西紅花苷類如西紅花苷Ⅲ和Ⅳ等也應(yīng)在432 nm處有最大紫外吸收。由于西紅花苷類成分是西紅花中的主要活性成分，該吸光度值的大小與單個(gè)或數(shù)個(gè)西紅花苷類成分含量的多少相比較，更能整體反映西紅花品質(zhì)。

綜上，將《中國藥典》2015年版中西紅花吸光度測(cè)定方法中的索氏提取方法改為超聲提取45 min，同時(shí)將樣品稀釋倍數(shù)由1000倍增加到1667倍，并規(guī)定避光操作，其余過程按《中國藥典》2015年版方法操作，新的方法更加快速，所得結(jié)果更加科學(xué)合理。利用改進(jìn)后的吸光度測(cè)定方法測(cè)定西紅花樣品，所得吸光度值可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地、不同等級(jí)的西紅花質(zhì)量。

4 討論

高效液相色譜法是當(dāng)前中藥質(zhì)量控制指標(biāo)的主流測(cè)定方法，但該方法測(cè)定的指標(biāo)有限，且測(cè)定過程耗時(shí)，成本較高。如對(duì)于西紅花藥材，《中國藥典》2015年版中采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，兩者之和的限度為西紅花質(zhì)量控制指標(biāo)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，國產(chǎn)西紅花樣品中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量之和占西紅花總苷的80%，而進(jìn)口西紅花為60%[16]，表明還有20%～40%的西紅花苷類成分沒有測(cè)定。增加中藥質(zhì)量控制指標(biāo)數(shù)是當(dāng)前中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)，但西紅花中除西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ外，其余西紅花苷類成分含量很低，并不適合采用高效液相色譜法測(cè)定，這在其他中藥中也較常見，如丹參中的丹參酮類成分、人參中的人參皂苷類成分、銀杏葉中的黃酮類成分，均僅能用液相色譜法測(cè)定幾個(gè)含量較高的成分。

紫外分光光度法測(cè)定速度快、成本低，在特定波長下，能夠同時(shí)對(duì)同類的多個(gè)組分快速完成測(cè)定，該測(cè)定值的大小可整體反映某類指標(biāo)量的差異，進(jìn)而評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。

本研究利用紫外分光光度法所得吸光度值準(zhǔn)確評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)地、不同等級(jí)的西紅花質(zhì)量，表明該測(cè)定方法可用于評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，是高效液相色譜法測(cè)定質(zhì)量控制指標(biāo)時(shí)的一個(gè)重要補(bǔ)充。另外，與常用的紫外分光光度法測(cè)定中藥中某類成分總的含量不同的是，本研究直接利用紫外分光光度法測(cè)定樣品溶液吸光度值即可，而不需要采用對(duì)照物質(zhì)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步降低了測(cè)試難度和成本。改進(jìn)后的西紅花吸光度值測(cè)定方法更加快速，所得結(jié)果更加科學(xué)、合理及準(zhǔn)確，為西紅花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。