康峻，吉莉莉，王衛(wèi)，白婷，黃倩

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

微生物在發(fā)酵食品中普遍存在，具有延長保質(zhì)期、改善營養(yǎng)價值、去除抗營養(yǎng)因子、富含益生菌和提升食品感官品質(zhì)等作用[1]。發(fā)酵肉制品中的微生物具有提高產(chǎn)品安全性、縮短成熟時間、提高營養(yǎng)價值等效果[2]。

傳統(tǒng)中式臘腸屬于非發(fā)酵型干香腸，原料肉絞制并與輔料混合，灌入腸衣后經(jīng)自然風干即成，產(chǎn)品特性與西式發(fā)酵腸有較大差異，屬于無外源微生物參與的發(fā)酵，產(chǎn)品風味主要取決于原料肉中內(nèi)源蛋白酶的作用。但在四川有一種醬香型香腸，添加了以四川微生物釀造的豆瓣、醪糟、豆豉等輔料。富含有益微生物的調(diào)味品與當?shù)靥囟ǖ臍夂驐l件結(jié)合，使得香腸在傳統(tǒng)制作的自然風干進程中也伴隨一定的微生物發(fā)酵進程，但風干迅速降低了香腸的Aw值，對微生物的發(fā)酵有一定的抑制，使香腸處于“淺發(fā)酵”狀態(tài)，也避免了香腸因深度發(fā)酵產(chǎn)生酸味。以此具有淺發(fā)酵特征的香腸傳統(tǒng)配方及制作方法為基礎(chǔ)，對發(fā)酵調(diào)味品進行篩選和優(yōu)化，采用智能自控設(shè)備，開發(fā)出一種命名為“淺發(fā)酵香腸”的產(chǎn)品[3]。前期研究表明, 參與淺發(fā)酵香腸發(fā)酵的微生物, 與西式發(fā)酵腸類似,主要包括乳酸菌、微球菌和酵母菌等, 西式發(fā)酵腸正是通過這些發(fā)酵菌的協(xié)同作用, 實現(xiàn)產(chǎn)品風味和品質(zhì)的提升。但是淺發(fā)酵香腸發(fā)酵時間短，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)的微生物含量有限，因此對pH的影響遠沒有西式發(fā)酵香腸大，而對其風味的提升作用更強[4]。前期研究顯示，淺發(fā)酵香腸不同于其他中式臘腸和西式發(fā)酵腸的顯著特點之一是調(diào)料中的微生物在生產(chǎn)加工進程中發(fā)揮的淺發(fā)酵作用，且發(fā)酵調(diào)味品種類和比例不同，對香腸的品質(zhì)也會呈現(xiàn)差異[5]。為此將調(diào)料經(jīng)滅菌處理作為對照，與未處理的試驗組比較，測定香腸加工進程及產(chǎn)品各項特性指標，以探究調(diào)料中的微生物對淺發(fā)酵香腸產(chǎn)品特性的影響。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)品配方、工藝及試驗設(shè)置

1.1.1 原輔料

豬前夾肉(瘦肉∶肥肉為7∶3)：由遂寧市高金食品有限公司提供；淺發(fā)酵香腸專用調(diào)料：由肉類加工四川省重點實驗室研制并提供。

1.1.2 制作工藝

將原料瘦肉和肥膘肉絞制混合，加入配料混勻后于4 ℃腌制24 h，灌入腸衣于7～13 ℃、相對濕度65%～75%、風速0.5～1.5 m/s條件下風干發(fā)酵成熟6 d，然后真空包裝后于15～20 ℃發(fā)酵6 d，即可外包裝后貯藏。

1.1.3 試驗設(shè)置

試驗組淺發(fā)酵香腸添加常規(guī)淺發(fā)酵香腸調(diào)料，將調(diào)料巴氏滅菌(90 ℃ 15 s)作為對照組，產(chǎn)品指標測定為第0，1，2，3，5，10，15天。

1.2 試驗材料

MRS乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基、PCA平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Chapman瓊脂培養(yǎng)基：均購自杭州百思生物技術(shù)有限公司?！皽\發(fā)酵香腸”輔料；成都大學四川肉類產(chǎn)業(yè)研究院提供。

1.3 儀器與設(shè)備

Testo 205pH計 德國儀表(深圳)有限公司；HD-3A型智能水分活度測量儀 無錫華科公司；TGL-20 M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司；ZFD-A5140鼓風干燥箱 上海智城公司；BCD-452WDPF冷藏冰箱 青島海爾集團；CR-400色彩色差計 日本柯尼卡美能達公司；仿天然風干發(fā)酵間 浙江嘉興艾博公司。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 微生物的測定

按照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，乳酸菌與微球菌的檢測參照張雪梅等的方法。在無菌條件下取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水中，置于拍打式均質(zhì)器中均質(zhì)10 min，取1 mL樣液進行10倍稀釋至適當?shù)臐舛?，?00 μL稀釋液，在PCA、甘露醇瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基中涂布，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別對菌落總數(shù)、微球菌和乳酸菌進行計數(shù)，在PDA和虎紅培養(yǎng)基中涂布，在28 ℃培養(yǎng)72～100 h，分別進行計數(shù)，每個樣品3個重復(fù)，對符合要求的平板中生長的菌落進行計數(shù)，計算出樣品中各種微生物的數(shù)量。

1.4.2 pH的測定

用酸度計的肉類專用穿刺電極直接插入腸體測定，待pH計度數(shù)穩(wěn)定后記錄。

1.4.3 水分活度Aw的測定

將樣品在室溫條件下切碎，取約2 g混勻的樣品鋪滿樣品盒的底部，使用水分活度儀測定。

1.4.4 TBA的測定

按照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》。準確稱取研磨均勻的樣品10.00 g,置于150 mL具塞三角瓶內(nèi),加入50 mL 7.5%三氯乙酸混合液，振搖30 min，用雙層濾紙過濾2次，除去油脂，準確移取上述濾液5 mL置于25 mL比色管中，加入5 mL 0.02 mmol/L TBA溶液，搖勻，加塞，置于90 ℃水浴鍋中保溫40 min，取出冷卻1 h，加入5 mL三氯甲烷，搖勻，靜置，將上清液移入小試管中在10000 r/min離心1 min,吸取上清液分別于532 nm、600 nm 處比色，同時以空白調(diào)零。

TBA=(D532 nm-D600 nm)÷155×0.1×72.6×100。

式中：D532 nm、D600 nm分別為上清液在532 nm、600 nm處的吸光值，其中與TBA反應(yīng)的物質(zhì)(TBARS)以每100 g 樣品中TBA的質(zhì)量表示。

1.4.5 色度值的測定

用切片機將香腸切成1 cm的薄片，用聚乙烯薄膜將背側(cè)面壓平，用CR-400色彩色差計進行色度值的客觀儀器分析其L*、a*和b*。

1.4.6 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定1.4.6.1 前處理條件

取3 g粉碎后的樣品于15 mL頂空瓶中密封，設(shè)置CTC自動進樣器對樣品的前處理條件：加熱箱溫度75 ℃，加熱時間45 min，樣品抽取時間20 min，解吸時間5 min。

1.4.6.2 GC條件

HP-5MS UI色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；壓力32.0 kPa；流速1.0 mL/min；載氣為He，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至85 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至105 ℃，保持2 min，再以12 ℃/min升至165 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃。

1.4.6.3 MS條件

電子電離源(EI)；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；檢測器電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍(m/z)：40～500。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有測試項目均進行3次重復(fù)，采用SPSS 25軟件進行顯著性分析及主成分分析；采用GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)趨勢分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物特性測定結(jié)果及分析

淺發(fā)酵香腸加工及冷藏期微生物變化見圖1～圖4。

圖1 乳酸菌的變化

圖2 酵母菌的變化

圖3 微球菌的變化

圖4 菌落總數(shù)的變化

隨著加工成熟時間的延長，兩組微生物數(shù)量逐步增加，兩組菌落總數(shù)穩(wěn)定上升，加工初期試驗組為6.11 lg CFU/g，對照組為5.71 lg CFU/g。發(fā)酵至第15天時，試驗組增至7.13 lg CFU/g，對照組為6.76 lg CFU/g。乳酸菌群穩(wěn)定上升，加工初期試驗組為6.08 lg CFU/g，對照組為4.18 lg CFU/g。至發(fā)酵風干第5天時對照組接近6 lg CFU/g，且包裝成熟第10天及以后升至6.21 lg CFU/g左右，試驗組在第15天時增長至7.14 lg CFU/g。試驗組微球菌變化分為兩個階段：第一階段為制作后到風干2 d，微球菌數(shù)量有所下降，由 6.34 lg CFU/g下降至6.07 lg CFU/g；第二階段在為第3～15 d，微球菌持續(xù)增長，最終為6.87 lg CFU/g。對照組微球菌的變化分為3個階段：第一階段為制作后到風干第2天，微球菌數(shù)量增長至5.37 lg CFU/g；第二階段在為第3～5天，微球菌降低至5.14 lg CFU/g；第三階段為第5～15天，香腸在真空包裝下冷藏，微球菌出現(xiàn)了增長，最終達到6.64 lg CFU/g。試驗組酵母菌數(shù)初始為5.30 lg CFU/g，之后逐步增長至6.23 lg CFU/g，對照組酵母菌的數(shù)量從第0～15天穩(wěn)定在4 lg CFU/g，沒有明顯變化。試驗組香腸在檢測中相同制作時間每種微生物數(shù)量均高于對照組，尤其是乳酸菌和酵母菌。最初，微球菌含量間的差異較大，至第15天時，兩組差異已不顯著，主要是由于鮮肉中本身含有一定的乳酸菌、微球菌等微生物[6]，是對照組香腸中主要的微生物來源。試驗組香腸的四川發(fā)酵調(diào)味品提供了豐富的有益微生物，使微生物的初始值高于對照組。

2.2 pH測定結(jié)果及分析

香腸在制作期及冷藏期pH的變化見圖5。

圖5 pH的變化

試驗組pH的變化主要呈現(xiàn)下降趨勢，并在第15天時下降至5.37。且在冷藏期pH變化更為明顯，結(jié)合微生物檢測結(jié)果來看，這是由于3～10 d中，乳酸菌大量增殖，產(chǎn)生乳酸使pH值顯著下降[7]。對照組香腸在制作期0～3 d，pH值下降較緩慢，由5.76下降至5.74，在貯藏期3～10 d，同組之間出現(xiàn)了顯著的下降(P<0.01)，由5.74下降至5.67，10～15 d的pH下降緩慢，最終pH值為5.60。兩組香腸在10～15 d pH下降緩慢，可能是由于氨基酸分解產(chǎn)生胺和肽，中和了香腸內(nèi)的酸性物質(zhì)，減緩了酸性物質(zhì)的積累[8]。在低溫條件下，發(fā)酵受到限制，因此pH值下降的幅度沒有超過0.2～0.4個單位，這與Bover-Cid等[9]報道的相似。因此，淺發(fā)酵腸中的微生物能促進香腸pH的下降，但是不會低至發(fā)酵香腸(pH≤4.8)的水平[10]。

2.3 Aw值測定結(jié)果及分析

淺發(fā)酵香腸水分活度Aw的變化見圖6。

圖6 Aw的變化

在風干發(fā)酵過程中，由于有規(guī)律變化的濕度和風速等模擬自然環(huán)境的加工條件，使香腸的Aw在最初的3 d快速下降，與第0天相比，第3天的Aw顯著下降(P<0.01)，試驗組由0.947減少至0.873，對照組由0.935減少至0.886。在之后的制作期與第3天相比，第15天的Aw繼續(xù)下降(P<0.05)，試驗組由0.873下降至0.847，對照組由0.886下降至0.877。微生物的增殖發(fā)酵使碳水化合物向有機酸轉(zhuǎn)變，使得瘦肉部分肌肉蛋白變性，肌肉束的收縮以及肌原纖維內(nèi)部和肌原蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間的水分流失[11]。試驗組的Aw從第2天開始顯著低于對照組(P<0.05)，說明發(fā)酵香腸中的微生物增殖對香腸中水分消耗較多，同時也能使pH下降，促進酸誘導(dǎo)的肌肉蛋白質(zhì)變性和凝膠化，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)的持水力降低，從而使得水分活度下降[12]。因此，淺發(fā)酵香腸中的微生物具有降低Aw值的作用，有利于延長保質(zhì)期。

2.4 TBA測定結(jié)果及分析

香腸的TBA含量的變化見圖7。

圖7 TBA含量的變化

兩組TBA的含量在增加，表明脂肪氧化的程度在增加，香腸中的內(nèi)源性脂肪酶以及微球菌能夠促進脂肪的氧化。3～5 d均有一個較明顯的增加，5 d后趨于較平穩(wěn)的變化，至第15天時，試驗組為0.66 mg/kg，對照組為0.76 mg/kg。而試驗組的TBA含量從第2天開始顯著低于對照組(P<0.05)，試驗組中乳酸菌含量較高，可能是乳酸菌在一定程度上抑制了脂質(zhì)氧化，雖然適當?shù)闹狙趸侨庵破凤L味成分的主要來源[13]，但是過度的脂肪氧化會影響香腸的品質(zhì)和風味。在冷藏期，對照組的TBA含量有所下降，試驗組的TBA含量增長變緩，可能是由于乳酸菌、酵母菌增長，在一定程度上抑制了脂肪的氧化[14]。盧涵等[15]研究表明乳酸菌、酵母菌在發(fā)酵香腸中起到了降低脂肪氧化水平的效果?？偟膩碚f，試驗組的TBA比同期對照組的低，這說明淺發(fā)酵香腸中的微生物具有一定的延緩脂肪氧化的作用。

2.5 色度值測定結(jié)果及分析

香腸在加工過程中色澤的變化見表1。

表1 色度值的變化

續(xù) 表

兩組亮度L*值在整個過程中呈現(xiàn)下降的趨勢，試驗組由63.44下降至51.59，對照組由63.26下降至51.67，兩組L*值沒有顯著性差異。對照組紅度a*值由18.26下降至14.57，試驗組由18.76下降至16.06。試驗組a*值相比于對照組下降得更為緩慢(P<0.05)。黃度b*值在風干期間比較穩(wěn)定，隨后在冷藏期有所下降，兩組之間沒有顯著性差異。發(fā)酵肉的顏色形成和穩(wěn)定性涉及微生物、酶和化學反應(yīng)，這些反應(yīng)受pH、色素濃度、氧化還原電位、溫度和水分的影響[16]。微球菌中的葡萄球菌帶有的過氧化酶對色澤的變化有著一定的影響[17]，試驗組a*值明顯高于對照組，說明香腸中微生物能夠延緩色澤衰退。

2.6 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定結(jié)果及分析

通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(SPME-GC-MS)測定淺發(fā)酵香腸中揮發(fā)性風味成分，見表2。

表2 淺發(fā)酵香腸加工過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

續(xù) 表

香腸加工初期試驗組與對照組檢測到3種類型的醛類，脂質(zhì)氧化的醛類揮發(fā)性化合物被認為是干發(fā)酵香腸和干火腿特征性味道和氣味的重要貢獻者[18]，與試驗組相比，對照組中與脂質(zhì)自氧化相關(guān)的己醛、壬醛百分比較高，己醛衍生自亞油酸氧化，庚醛是n-6和n-9多不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物[19]。苯乙醛的百分比增加源自微生物氨基酸代謝，苯乙醛被發(fā)現(xiàn)是對干香腸風味有積極貢獻的化合物之一[20]。兩組香腸中檢測到的4種醇，芳樟醇、桉葉油醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇，均來自香腸制備過程中添加的香料。試驗組的芳樟醇在成熟期間含量低于對照組，是由于芳樟醇與酸的酯化。檢測到另外3種類型的醇,2,3-丁二醇和苯乙醇主要由微生物通過氨基酸分解代謝產(chǎn)生[21]，2,3-丁二醇是乳酸菌代謝的副產(chǎn)物[22]，試驗組的2,3-丁二醇在成熟后期含量高于對照組(P<0.05)。還檢測到1-辛烯-3-醇，它具有明顯的蘑菇味，并且具有較低的感官閾值[23]，1-辛烯-3-醇的濃度與青霉菌的生長有關(guān)[24]。另外，在發(fā)酵開始時檢測到了己酸，在整個過程總共鑒定出4種類型的酸，檢測到源自脂質(zhì)自氧化化合物的戊酸[25]。3-甲基戊酸的百分比在發(fā)酵過程中先增加再減少，可能與氨基酸的分解氧化有關(guān)，?；撬?卡迪諾醋酸是一種不常見的酸，可能來自調(diào)味品。一般情況下，酸是形成酯的底物。酯是重要的揮發(fā)性化合物，其檢測閾值低，對于香腸獨特風味的形成有著重要的作用[26]，酯主要是短鏈酸與醇由微生物的酯酶進行酯化作用[27]。乙酯非常重要，它使香腸具有成熟的果香[28]。 檢測到乙酯，例如己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸芳樟酯可以通過葡萄球菌和乳酸菌的酯化活性來解釋，并且明顯試驗組的乙酯含量高于對照組(P<0.05)。潛在的酯化作用還取決于pH值、溫度和生產(chǎn)香腸所使用的原料[29]。乙酯類化合物，主要是短鏈酸生成的酯類，可賦予產(chǎn)品香甜風味，并且能夠掩蓋游離脂肪酸帶來的不愉快氣味[30]，如己酸乙酯富有果香味，辛酸乙酯則具有酒香氣息。乙酸芳樟酯具有檸檬、薰衣草幽香氣味。在加工期間，在試驗組和對照組中鑒定出4種酮，這些化合物的百分比在發(fā)酵過程中降低，其中2-壬酮源自微生物的β-氧化作用，這可能歸因于葡萄球菌的存在[31]。接種的香腸中這些甲基酮的百分比高于對照組(P<0.05)。此外，由LAB碳水化合物分解代謝產(chǎn)生的3-羥基-2-丁酮也有助于產(chǎn)生水果味，并且在試驗組中百分比高于對照組(P<0.05)。

兩組香腸中檢測到烯烴類化合物數(shù)量達8種，相對含量均較高，例如D-檸檬烯、姜黃烯、石竹烯屬萜類物質(zhì)，但此類物質(zhì)對產(chǎn)品風味的影響較小，更多的是對香腸風味起協(xié)調(diào)作用，其他揮發(fā)性化合物如茴香腦、草蒿腦等主要源于所添加的發(fā)酵調(diào)味品。

根據(jù)揮發(fā)性化合物的結(jié)果，淺發(fā)酵香腸風味物質(zhì)主要來源于添加的發(fā)酵調(diào)味品。兩組淺發(fā)酵香腸中酯類化合物在冷藏期間緩慢增長，試驗組的醛類化合物相較于對照組的含量較低，結(jié)合乳酸菌和微球菌的生長情況，表明微生物進行著一定的發(fā)酵作用，并且乳酸菌的增長帶來了一定的抑制脂質(zhì)氧化的作用。綜上，說明香腸微生物能夠促進風味物質(zhì)的形成。

3 結(jié)論

以富含有益微生物的四川發(fā)酵調(diào)味品為輔料，在智能仿天然風干發(fā)酵間中制作具有四川傳統(tǒng)醬香風味的淺發(fā)酵香腸。將調(diào)料經(jīng)滅菌處理作為對照，與未處理的試驗組比較，研究了調(diào)料中的微生物對香腸產(chǎn)品特性的影響。結(jié)果表明，與試驗組比較，加工各階段及產(chǎn)品中對照組的菌落總數(shù)、乳酸菌、酵母菌、微球菌同期均顯著更高(P<0.05)。試驗組和對照組的菌落總數(shù)及乳酸菌皆增長穩(wěn)定，試驗組微球菌增長分為兩個階段：風干發(fā)酵期由6.34 lg CFU/g下降至6.07 lg CFU/g，之后穩(wěn)定增長至6.87 lg CFU/g；對照組微球菌增長分為3個階段：由風干發(fā)酵期2 d時從5.12 lg CFU/g增長至5.37lg CFU/g，加工至5 d時從5.37 lg CFU/g降低至5.14 lg CFU/g，之后穩(wěn)定增長至6.64 lg CFU/g。試驗組酵母菌隨著加工時間的變化而穩(wěn)定增長，而對照組在整個加工過程中無明顯增長變化。至第15天時，試驗組產(chǎn)品菌落總數(shù)達到7.13 lg CFU/g，乳酸菌7.14 lg CFU/g，酵母菌6.23lg CFU/g，微球菌6.87 lg CFU/g，且與對照組比較呈現(xiàn)更低的pH、TBA及Aw，更為緩慢的色澤衰變。此時對照組pH為5.37，試驗組為5.60；TBA值對照組為0.76 mg/kg，試驗組為0.66 mg/kg；Aw值對照組為0.877，試驗組為0.847。產(chǎn)品色度值的測定結(jié)果：試驗組的L*、a*和b*值分別為51.59，16.06和28.77，而對照組的L*、a*和b*值分別為51.67，14.57和26.74。揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測結(jié)果表明，試驗組的酯類、酮類、醇類相對含量顯著高于對照組(P<0.05)，試驗組分別為12.08%、0.94%和6.98%，而對照組分別為3.65%、0%和5.82%。而醛類試驗組顯著低于對照組(P<0.05)，試驗組為10.16%，對照組為13.98%。對產(chǎn)品的各項特性指標進行綜合評定，淺發(fā)酵香腸中由發(fā)酵調(diào)味品組成的調(diào)料引入的微生物具有降低香腸的酸度，賦予產(chǎn)品良好色澤，延緩香腸氧化酸敗，促進風味物質(zhì)形成的作用，而有關(guān)調(diào)料中微生物對淺發(fā)酵香腸特性影響的機制有待進一步探究。