黃鈺，王凱，伍雅勵(lì)，趙文梅，陳禹锜，李楠

(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

甘蔗(sugarcane)為多年生高大實(shí)心草木，主要生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國(guó)的甘蔗產(chǎn)量位居世界第三，廣西是全國(guó)最大的甘蔗產(chǎn)地，但是目前廣西地區(qū)的甘蔗基本應(yīng)用于制糖業(yè)，為更好地發(fā)揮其地理優(yōu)勢(shì)，如何擴(kuò)大甘蔗加工這一問題急需解決[2]。近年來(lái)，隨著大眾對(duì)健康生活的不斷追求，果醋因具有保健功效和能保留水果中原有的營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜愛[3]。果醋不僅含有人體所需的各種氨基酸、維生素和有機(jī)酸類物質(zhì)[4]，還具有抗氧化、降血糖和降膽固醇等作用[5]。因此，將甘蔗加工成甘蔗果醋是一種有效的解決方法。甘蔗有充足的糖分和水分以及豐富的維生素和礦物質(zhì)，對(duì)人體新陳代謝有極大益處[6]。甘蔗果醋含有多酚和黃酮等物質(zhì)，多酚具有較強(qiáng)的抗氧化功能[7]，黃酮可以清除人體中的游離自由基，起到延緩衰老的作用[8]。但甘蔗果醋含有大量蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等物質(zhì)，在生產(chǎn)和儲(chǔ)存時(shí)上述物質(zhì)會(huì)發(fā)生聚合作用產(chǎn)生沉淀物，導(dǎo)致甘蔗果醋渾濁[9]，嚴(yán)重影響人們的感官體驗(yàn)。酸性蛋白酶是一種蛋白酶，能在較低pH下水解蛋白質(zhì)[10]，也能夠?qū)⒏收峁字械牡鞍踪|(zhì)水解為氨基酸和多肽，進(jìn)而使其沉淀。為解決甘蔗果醋中的非生物性渾濁沉淀的問題，本試驗(yàn)利用酸性蛋白酶來(lái)處理甘蔗果醋，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化酸性蛋白酶對(duì)甘蔗果醋的澄清效果，以達(dá)到最佳澄清效果。通過甘蔗果醋感官評(píng)價(jià)表，對(duì)在最佳澄清條件下澄清前后的甘蔗果醋進(jìn)行評(píng)價(jià)打分，并測(cè)定在最佳澄清條件下澄清前后的甘蔗果醋還原糖、總多酚、黃酮、蛋白質(zhì)及酸度等理化性質(zhì)，為甘蔗果醋進(jìn)一步發(fā)展利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；甘蔗果酒、甘蔗果醋：本實(shí)驗(yàn)室自釀；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院朗姆酒研發(fā)實(shí)驗(yàn)室自篩；酸性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP201N電子天平 上海菁華科技儀器有限公司；PL-303分析天平 Mettler Toledo有限公司；UV mini-1240紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司；恒溫水浴鍋、SN510C全自動(dòng)高壓滅菌鍋 重慶雅馬拓科技有限公司；MQD-S2R搖床 上海旻泉儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗果醋釀造工藝

1.3.2 甘蔗果醋澄清單因素試驗(yàn)

酸性蛋白酶添加量：將添加量為0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰的酸性蛋白酶分別加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后置于50 ℃的恒溫水浴鍋中，酶解6 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計(jì)在725 nm下測(cè)其透光率。

酶解時(shí)間：將添加量為0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后置于50 ℃的恒溫水浴鍋中，分別在酶解2，4，6，8，10，12 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計(jì)在725 nm下測(cè)其透光率。

酶解溫度：將添加量為0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后分別置于35，40，45，50，55，60 ℃的恒溫水浴鍋中，酶解6 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計(jì)在725 nm下測(cè)其透光率。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化甘蔗果醋澄清工藝試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酸性蛋白酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)和酶解溫度(C)為影響因素，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，以透光率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 甘蔗果醋理化性質(zhì)研究

還原糖含量的測(cè)定：采用DNS法[11]；總多酚含量的測(cè)定：采用Folin-Ciocalteu法[12]；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[13]；酸度的測(cè)定：采用中和滴定法[14]。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

將10份甘蔗果醋樣品隨機(jī)分發(fā)給10名專業(yè)感官評(píng)價(jià)員，按照色澤、氣味、酸度、澄清度及口感5個(gè)評(píng)分項(xiàng)目對(duì)甘蔗果醋進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 甘蔗果醋感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定的平均值，響應(yīng)面圖采用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行分析，采用Graphpad Prism 8.0作圖，方差分析和顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)甘蔗果醋的澄清效果

2.1.1 酸性蛋白酶添加量對(duì)甘蔗果醋的澄清效果

在酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為50 ℃的條件下，考察酸性蛋白酶添加量為0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰對(duì)甘蔗果醋的澄清效果，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酸性蛋白酶添加量對(duì)甘蔗果醋透光率的影響

由圖1可知，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，甘蔗果醋的透光率遞增，當(dāng)添加量達(dá)到1.0‰時(shí)，甘蔗果醋的透光率達(dá)到最大值81.1%，之后隨著添加量增加，透光率反而下降。因?yàn)樗嵝缘鞍酌冈蕉啵浞纸飧收峁椎哪芰υ綇?qiáng)，但是酸性蛋白酶過多會(huì)導(dǎo)致甘蔗果醋中存在的大分子物質(zhì)過量，從而有渾濁沉淀形成。綜上所述，選擇1.0‰為最佳添加量。

2.1.2 酸性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量為0.8‰，酶解溫度為50 ℃的條件下，考察酶解時(shí)間為2，4，6，8，10，12 h對(duì)甘蔗果醋的澄清效果，結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗果醋透光率的影響

2.1.3 酸性蛋白酶酶解溫度對(duì)甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量為0.8‰，酶解時(shí)間為6 h的條件下，考察酶解溫度為35，40，45，50，55，60 ℃對(duì)甘蔗果醋的澄清效果，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶解溫度對(duì)甘蔗果醋透光率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，甘蔗果醋的透光率先增加后減少，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為86.5%。因?yàn)殡S著酶解溫度的升高，酸性蛋白酶活性也隨之提高，當(dāng)達(dá)到最適酶解溫度的臨界點(diǎn)后，溫度的增加會(huì)影響其酶活，從而減弱澄清效果。綜上所述，選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)甘蔗果醋的澄清作用

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酸性蛋白酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)和酶解溫度(C)為影響因素，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)甘蔗果醋澄清優(yōu)化試驗(yàn)，以透光率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，回歸模型方差分析結(jié)果見表4，方差相關(guān)系數(shù)見表5。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

表5 方差相關(guān)系數(shù)

利用分析軟件Design-Expert對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行多元回歸方程擬合，得透光率(Y)二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=88.38+1.16A+0.40B+0.36C-0.38AB-0.15AC-0.82BC-0.52A2-0.79B2-2.21C2。

由表4可知，模型的P值=0.0201<0.05，達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)的P值=0.1579>0.05，為不顯著水平，說明模型可靠，擬合性良好。一次項(xiàng)A的P值=0.0106<0.05，說明酸性蛋白酶添加量對(duì)甘蔗果醋的澄清效果顯著；一次項(xiàng)B和C的P值均大于0.05，說明酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)甘蔗果醋的澄清效果不顯著；交互項(xiàng)AB、AC、BC和二次項(xiàng)A2、B2的P值均大于0.05，說明上述因素對(duì)甘蔗果醋的澄清效果不顯著，酸性蛋白酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度之間的交互作用較弱；二次項(xiàng)C2=0.0020<0.01，說明其對(duì)甘蔗果醋的澄清效果極顯著。由F值可得因素A>B>C，即對(duì)甘蔗果醋澄清效果影響順序?yàn)椋核嵝缘鞍酌柑砑恿?酶解時(shí)間>酶解溫度。

轉(zhuǎn)變教師傳統(tǒng)教學(xué)思維模式，使其真正意識(shí)到信息技術(shù)對(duì)教學(xué)的作用和意義，將信息技術(shù)實(shí)際運(yùn)用到教學(xué)實(shí)踐當(dāng)中，只有當(dāng)教師的思想改變后才能保證信息化教學(xué)的順利開展。在信息化教學(xué)方式下，學(xué)生作為教學(xué)主體，但并不代表教師在教學(xué)中的作用減少，反而是對(duì)教師的素質(zhì)做出了更高的要求，要做好學(xué)生的引導(dǎo)者、協(xié)調(diào)者、促進(jìn)者和激勵(lì)者。

由表5可知，擬合度R2=0.8706和校正擬合度RAdj2=0.7042數(shù)據(jù)相差小，說明所設(shè)計(jì)的模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合度較好，可靠性較高；信噪比=6.294>4，說明模型的可信度高；CV=1.10%<5%。綜上所述，證明該模型準(zhǔn)確性好，可以用來(lái)分析各因素變化對(duì)響應(yīng)值的影響。

2.2.2 各影響因素交互作用分析

各因素對(duì)指標(biāo)影響的響應(yīng)面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)甘蔗果醋澄清度影響的響應(yīng)曲面

等高線為橢圓，曲面斜度越高，坡度越陡，則各因素對(duì)甘蔗果醋澄清度作用越顯著。由圖4可知，在模型中AB、BC、AC的交互作用不顯著，說明與表4所得數(shù)據(jù)一致。

利用響應(yīng)面法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，選擇透光率的最大響應(yīng)值，得到的最佳響應(yīng)結(jié)果為酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時(shí)間為3.98 h，酶解溫度為55.25 ℃，此優(yōu)化條件下澄清透光率的預(yù)測(cè)值為89.03%。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)準(zhǔn)確性，由于實(shí)際操作情況不能精準(zhǔn)達(dá)到上述優(yōu)化條件，因此調(diào)整為酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時(shí)間為4 h，酶解溫度為55 ℃,在此澄清工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到甘蔗果醋的澄清透光率為91.9%，澄清結(jié)果與試驗(yàn)預(yù)測(cè)值相近，說明該模型可靠，可以應(yīng)用響應(yīng)面對(duì)甘蔗果醋澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 澄清前后甘蔗果醋理化性質(zhì)研究結(jié)果

由表6可知，經(jīng)過最佳澄清工藝優(yōu)化后，甘蔗果醋中還原糖、總多酚、蛋白質(zhì)及總酸相較澄清前均略有下降。

表6 澄清前后甘蔗果醋理化性質(zhì)變化

2.4 澄清前后甘蔗果醋感官變化

根據(jù)表2對(duì)澄清前后甘蔗果醋進(jìn)行感官評(píng)價(jià)后的結(jié)果為：澄清前的甘蔗果醋呈昏暗深褐色，略有果香和醋味，酸味較刺鼻，不透亮且口感單一，得分為62分；澄清后的果醋呈鮮明琥珀色，有香甜的甘蔗香味，酸味濃厚，十分清透且口感豐富，得分為89分。因此，使用酸性蛋白酶對(duì)甘蔗果醋進(jìn)行澄清具有極佳的感官效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法得到酸性蛋白酶對(duì)甘蔗果醋的最佳澄清條件為：酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時(shí)間為4 h，酶解溫度為55 ℃，在此條件下甘蔗果醋的透光率可達(dá)到91.9%。甘蔗果醋經(jīng)最佳澄清條件澄清后，其還原糖、總多酚、蛋白質(zhì)和總酸均略下降，但影響不大；感官品質(zhì)有很大的提升，感官評(píng)分從62分提高到89分，所得的甘蔗果醋品質(zhì)極佳，為甘蔗果醋應(yīng)用于調(diào)味品方面提供了理論依據(jù)。