楊坤,吳凱儀,張建煬,顧陽,劉桂瓊,管春成
(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心,貴州 凱里 556012)
魚醬酸調(diào)味料是貴州省黔東南州苗族地區(qū)原生態(tài)飲食的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味料食品,是以雷公山區(qū)域內(nèi)溪流中魚扇子、爬巖魚等河魚和當(dāng)?shù)胤N植的鮮辣椒為主要原料,配以食鹽、生姜、白酒、醪糟、大米等輔料,采用傳統(tǒng)密閉發(fā)酵工藝釀制而成的一種新型半固態(tài)調(diào)味料[1-3],其不僅富含大量人體必需的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),而且具有提高食欲、健胃作用。氨基酸作為魚醬酸的重要營養(yǎng)指標(biāo)之一,其組成和含量能夠在一定程度上反映魚醬酸的原材料來源和發(fā)酵程度,目前很少有研究報道魚醬酸調(diào)味料中氨基酸含量成分。因此,氨基酸含量成分的檢測對魚醬酸調(diào)味料的營養(yǎng)價值研究和質(zhì)量控制具有十分重要的意義。
目前,氨基酸的分析方法包括柱后衍生-高效液相色譜法[4-9]、離子交換色譜法[10-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-15]。其中以柱后衍生-高效液相色譜法技術(shù)研制的氨基酸分析儀已被廣泛應(yīng)用于氨基酸分析,但其具有耗時長、檢出限高等缺點,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度、高效快速和高通量等優(yōu)點而成為最近幾年國內(nèi)外分析氨基酸含量的熱點[16-18]。本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù),建立同時快速測定魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸的檢測方法。
1.1.1 試劑
17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸含量均為1.00 μmol/mL):壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。
甲醇(色譜純):德國Merck公司;甲酸(色譜純)、鹽酸(優(yōu)級純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為實驗室自制超純水;魚醬酸樣品:購于當(dāng)?shù)爻小?/p>
1.1.2 儀器
AB SCIEX API 4000+質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) 美國AB SCIEX公司;Agilent 1290 Infinity II型液相色譜儀 美國Agilent公司;Milli-Q純水機(jī) 美國Millipore公司;ML104電子天平 瑞士梅特勒-托利多(上海)儀器公司;3-18k型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司; KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。
準(zhǔn)確吸取1.00 μmol/mL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成濃度為100 nmol/mL的儲備液溶液,保存于4 ℃冰箱中,備用。
分別精密吸取不同體積的氨基酸儲備溶液,用水稀釋成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度見表2),然后進(jìn)液相色譜-質(zhì)譜儀分析測定,繪制峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.1 樣品處理方法
水解氨基酸:稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中,加30 mL水超聲40 min溶解,冷卻至室溫后定容至刻度,在6000 r/min下離心10 min,然后取適當(dāng)溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度,過0.22 μm水相濾膜,取續(xù)濾液上機(jī)。
酸水解氨基酸:稱取1.00 g樣品于20 mL水解管中,加入10 mL 6 mol/L鹽酸,充氮氣后蓋緊旋蓋,于110 ℃下酸解22 h后取出冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移水解液至50 mL離心管中并用水多次沖洗水解管,用水定容至刻度,振蕩混勻,在6000 r/min下離心10 min,然后取適當(dāng)溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度,過0.22 μm水相濾膜,取續(xù)濾液上機(jī)。
1.3.2 分析條件
色譜條件:Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),流動相A為水溶液(含0.1%甲酸),B為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序:0~1.50 min,1.0% B;1.50~2.00 min,20% B;2.00~3.00 min,80% B,3.00~4.90 min,80% B,4.90~5.00 min,1.0% B。后運行2.50 min,流速0.2 mL/min;進(jìn)樣量2 μL;柱溫:30 ℃。
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子電離模式,去溶劑溫度:500 ℃;氣簾氣壓力:172 kPa;碰撞氣壓力:41 kPa;離子氣1壓力:414 kPa;離子氣2壓力:379 kPa;離子噴射電壓:5500 V;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,其他質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。
表1 氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)
1.3.3 計算公式
采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算氨基酸含量:
式中:X為式樣中氨基酸的含量,%;c為待測樣品各氨基酸的含量,nmol/mL;F為試樣稀釋倍數(shù);V為試樣定容體積,mL;M為氨基酸分子質(zhì)量;m為試樣質(zhì)量,g;109為樣品含量換算系數(shù)。
由于氨基酸分子含有氨基和羧基兩種官能團(tuán),其極性較大,本研究首先選擇了Waters ACQUITY UPLC BEH Hilic(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)兩根親水色譜柱考察其保留效果,研究發(fā)現(xiàn)部分氨基酸出現(xiàn)拖尾和分叉現(xiàn)象,原因可能是樣品溶液用水溶解導(dǎo)致在Hilic親水色譜模式下出現(xiàn)溶劑擴(kuò)散效應(yīng)。而大部分氨基酸在普通C18色譜柱上保留效果較差,樣品中大量的強極性干擾物質(zhì)會干擾目標(biāo)化合物,導(dǎo)致一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此,本研究選擇對親水有較大保留效果的T3色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3,100 mm×2.1 mm,1.7 μm)進(jìn)行分離,達(dá)到了較好的分離效果,其正離子多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。
圖1 17種氨基酸的MRM色譜圖
進(jìn)一步對流動性的種類進(jìn)行考察,當(dāng)選擇乙腈作為有機(jī)相時,亮氨酸和異亮氨酸無法實現(xiàn)基線分離,甲醇為流動相時,亮氨酸和異亮氨酸能達(dá)到較好的分離,并且保留效果增強。選擇甲酸銨和乙酸銨作為水相時,部分氨基酸出現(xiàn)信號抑制現(xiàn)象。因此,選擇0.1%甲酸水溶液作為水相能確保17種氨基酸的靈敏度。
在離子源正離子模式下以流動注射方式對17種氨基酸進(jìn)行母離子(Q1)全掃描,確定各目標(biāo)化合物的母離子,再對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描(MS2),對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子,丙氨酸和脯氨酸沒有找到合適的第2對特征離子,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
在優(yōu)化的UPLC-MS/MS分析條件下,17種氨基酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9982~0.9999,以定量離子3倍信噪比(S/N=3)得到檢出限(LOD),以定量離子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ),17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見表2。
表2 17種氨基酸的線性方程、檢出限和定量限
按照1.3.1對7批次魚醬酸樣品進(jìn)行處理,17種氨基酸水解總含量為0.520%~3.335%,其中胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和組氨酸含量低于0.03%,丙氨酸和亮氨酸含量高于0.15%。17種氨基酸酸水解總含量為1.807%~3.889%,其中氨酸、胱氨酸、酪氨酸和蘇氨酸含量低于0.10%,其中一批次魚醬酸調(diào)味料的水解和酸水解的17種氨基酸含量成分變化見圖2。
圖2 魚醬酸調(diào)味料中水解和酸水解的氨基酸含量
由圖2可知,酸水解后的魚醬酸中魚肉蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變氨基酸,其中和甘氨酸、纈氨酸和脯氨酸變化最大。
同時,對7批次魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸進(jìn)行含量分析,結(jié)果見圖3。
圖3 魚醬酸調(diào)味料中各氨基酸含量
由圖3可知,7批次魚醬酸調(diào)味料中亮氨酸的含量較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.338%~1.219%,甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的含量處于同一水平,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.008%~0.690%,絲氨酸、甲硫氨酸、組氨酸含量處于同一水平,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%~0.203%,胱氨酸含量最低,低于0.006%。
本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸含量,使用兩種不同的樣品前處理方式對魚醬酸調(diào)味料中氨基酸進(jìn)行分析,確定了魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸的含量。本方法極大縮短了分析時間,在分析復(fù)雜樣品時可以獲得較高的選擇性和靈敏度,適用于食品中快速測定氨基酸的定性和定量分析。