潘倩，劉艷梅，周賢棟，潘學(xué)軍，楊本芹

(昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650500)

剩余污泥是指污水處理廠在對(duì)污水進(jìn)行生化處理時(shí)產(chǎn)生的不同廢棄物的混合物。近年來(lái)，隨著污水處理量的不斷增多，剩余污泥的產(chǎn)量也逐年上升，預(yù)計(jì)2020年—2025年間，污泥的年產(chǎn)量有望突破6 000萬(wàn)t(以含水率80%計(jì)算)[1]。研究表明，剩余污泥的處理處置費(fèi)用高達(dá)整個(gè)污水廠總運(yùn)行費(fèi)用的65%[2]，超過(guò)80%的污泥因處理不當(dāng)成為環(huán)境的二次污染源[3]。因此，將污泥進(jìn)行有效處理，以減少其對(duì)環(huán)境的污染是目前水處理行業(yè)發(fā)展的重中之重。

剩余污泥中含有大量蛋白質(zhì)(約占污泥總量的30%～60%)，充分利用其中的蛋白質(zhì)，一方面可以達(dá)到污泥資源化的目的，另一方面還能減輕剩余污泥對(duì)環(huán)境的危害[4]。蛋白質(zhì)資源化途徑包括動(dòng)物飼料、木材粘合劑、泡沫滅火劑以及混凝土發(fā)泡劑等。Hwang等[5]發(fā)現(xiàn)，在污泥中提取出來(lái)的蛋白質(zhì)重金屬含量低于法定標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果中也不含黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和沙門氏菌D組等有毒有害物質(zhì)，且對(duì)其進(jìn)行白鼠試驗(yàn)無(wú)明顯影響，證實(shí)其應(yīng)用于動(dòng)物飼料具有可行性。Pervaiz等[6]發(fā)現(xiàn)，從污泥中回收的蛋白質(zhì)較未處理的污泥抗剪強(qiáng)度有很大提升，有作為木材粘合劑的巨大潛能。Li等[7]發(fā)現(xiàn)，對(duì)啤酒廠污泥進(jìn)行處理后，其中提取出的蛋白質(zhì)可作為復(fù)合蛋白發(fā)泡劑使用。由此可見(jiàn)，剩余污泥中提取回收的蛋白質(zhì)有很大的利用空間。

截至目前，剩余污泥中蛋白質(zhì)的提取技術(shù)還未得到廣泛應(yīng)用，其原因主要是效率低、不經(jīng)濟(jì)。污泥預(yù)處理是目前使用最多的提高蛋白質(zhì)溶出效率的方法，其中主要包含熱預(yù)處理[8]、堿預(yù)處理[9]、臭氧預(yù)處理[10]、超聲預(yù)處理[11]、酶預(yù)處理[12]以及其中幾種處理方式形成的聯(lián)合預(yù)處理。在單獨(dú)預(yù)處理方式中，不同的預(yù)處理方式都存在其相應(yīng)的缺點(diǎn)，例如，熱預(yù)處理能耗較高，堿預(yù)處理對(duì)儀器腐蝕較大，臭氧預(yù)處理適用范圍過(guò)窄，超聲預(yù)處理難以應(yīng)用到實(shí)際工程中等[13]。聯(lián)合預(yù)處理是基于不同預(yù)處理方式的作用條件，充分考慮其協(xié)同作用，進(jìn)一步提高污泥細(xì)胞的溶解效率的一種高效預(yù)處理方法。目前，大部分研究者對(duì)單獨(dú)的預(yù)處理提取蛋白質(zhì)進(jìn)行了許多條件優(yōu)化，但很少有對(duì)不同預(yù)處理方法進(jìn)行比較并對(duì)所提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化回收的研究。

筆者采用熱堿聯(lián)合預(yù)處理[14]、超聲堿聯(lián)合預(yù)處理[15]和溶菌酶預(yù)處理[16]3種預(yù)處理方法，通過(guò)對(duì)溶出蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行分析，探究其發(fā)揮破胞作用的最優(yōu)條件，并分別比較3種方法提取蛋白質(zhì)的效果，最后優(yōu)化等電點(diǎn)法，確定回收純化蛋白質(zhì)的最佳pH值，旨在為污泥中蛋白質(zhì)的提取利用提供相應(yīng)參考。

1 材料與方法

剩余污泥取自昆明市污水廠的污泥濃縮池，該廠內(nèi)采用A2/O(Anaerobic-Anoxic-Oxic)工藝進(jìn)行污水生物處理。剩余污泥主要理化性質(zhì)如表1所示。

表1 污泥基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of raw sludge

試驗(yàn)以蛋白質(zhì)濃度為主要指標(biāo)來(lái)確定各項(xiàng)預(yù)處理方法的最優(yōu)破胞條件。原始污泥總蛋白濃度使用凱氏定氮法[17]測(cè)定，離心后的上清液中蛋白質(zhì)采用BCA蛋白質(zhì)試劑盒[18]結(jié)合酶標(biāo)儀(MultiskanTMFC，賽默飛世爾科技)測(cè)定。

凱氏定氮法蛋白質(zhì)計(jì)算見(jiàn)式(1)。

(1)

式中：X為蛋白質(zhì)含量，g/(100 g)；V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mol/L；m為試樣的質(zhì)量，g；V3為吸取消化液的體積，mL；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，取6.25。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將污水廠所取剩余污泥濃度調(diào)至約20 000 mg/L，然后分別進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1 熱堿破解剩余污泥試驗(yàn)

熱堿破解污泥試驗(yàn)主要從pH值、溫度、時(shí)間3個(gè)影響因素來(lái)考察污泥溶胞效果，設(shè)置如下單因素試驗(yàn):

1)pH優(yōu)化試驗(yàn)。 參照崔靜等[19]和翟世民等[20]的研究，在破胞溫度為140℃、時(shí)間為2 h的條件下，在5個(gè)燒杯中分別取100 mL的剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液將pH值分別調(diào)至9、10、11、12和13后在恒溫箱(XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中進(jìn)行溶胞，優(yōu)化出最優(yōu)pH值。

2)溫度優(yōu)化試驗(yàn)。 在6個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，恒溫箱溫度分別調(diào)節(jié)為100、120、140、160、180、200 ℃，在優(yōu)化得到的最優(yōu)pH值條件下破胞2 h，得到最優(yōu)溫度。

3)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)。 在6個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優(yōu)pH值和溫度下，分別破胞0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時(shí)所用時(shí)間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時(shí)間重復(fù)前兩個(gè)步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 超聲-堿聯(lián)合破解污泥試驗(yàn)

超聲聯(lián)合堿破解污泥試驗(yàn)主要從pH值、超聲功率、超聲時(shí)間3個(gè)影響因素考察污泥破胞效果，設(shè)定如下單因素試驗(yàn)：

1)pH值優(yōu)化試驗(yàn)。 參照康曉榮[21]的研究，在溶胞功率為3 W/mL(超聲期間超聲3 s停1 s)、時(shí)間為30 min的條件下，在5個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，依次為9、10、11、12和13，進(jìn)行破胞，優(yōu)化出最優(yōu)pH值。

2)功率優(yōu)化試驗(yàn)。 在6個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在最優(yōu)pH值條件下調(diào)節(jié)超聲功率，依次為1、2、3、4、5、6 W/mL，破胞30 min，優(yōu)化出最優(yōu)功率。

3)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)。 在5個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優(yōu)pH值和超聲功率條件下依次破胞10、20、30、40、50 min，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時(shí)所用時(shí)間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時(shí)間重復(fù)前兩個(gè)步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 溶菌酶破解污泥試驗(yàn)

溶菌酶(溶菌酶凍干粉，北京索萊寶科技有限公司)破解試驗(yàn)主要從pH值、酶濃度、處理時(shí)間3個(gè)影響因素來(lái)考察污泥的破胞效果，設(shè)定如下單因素試驗(yàn)：

1)pH值優(yōu)化試驗(yàn)。 溶菌酶試驗(yàn)參照陸鈞皓[22]的研究，在12個(gè)燒杯中分別取100 mL剩余污泥，其中6個(gè)保持酶濃度在200 mg/g，依次調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h；另外6個(gè)在不加酶的情況下，依次調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h；依據(jù)兩者差值即可分析酶單獨(dú)作用時(shí)的最優(yōu)pH值。

2)酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)。 在7個(gè)燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，依次調(diào)節(jié)燒杯酶濃度為60、90、120、150、200、250、280 mg/g，在確定的最優(yōu)pH值和室溫下破胞4 h，優(yōu)化出最優(yōu)酶濃度。

3)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)。 在7個(gè)燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，調(diào)節(jié)酶濃度及pH值為確定的最優(yōu)值，室溫下依次反應(yīng)2、3、4、5、6、7、8 h，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時(shí)所用時(shí)間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時(shí)間重復(fù)前兩個(gè)步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

經(jīng)以上每種因素預(yù)處理后的污泥溶液均在8 000 rpm高速冷凍離心機(jī)上離心20 min，離心后上清液過(guò)0.45 μm濾膜，取濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定，以得到高效經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法及其最優(yōu)作用條件。

2.4 溶菌酶對(duì)提取后蛋白質(zhì)的影響

以熱堿預(yù)處理為例，測(cè)定熱堿預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液，得到蛋白質(zhì)濃度值P1。再分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的溶菌酶凍干粉加入100 mL水中，得到6種不同濃度的溶菌酶溶液，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度依次為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6。取預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液，分別與6種配制溶菌酶溶液各5 mL進(jìn)行混合，得到10 mL不同濃度蛋白質(zhì)混合液，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度依次為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。最后檢驗(yàn)等式(2)是否成立，以探究溶菌酶對(duì)提取后蛋白質(zhì)濃度的影響。

(2)

式中，x的取值范圍為1～6。

2.5 等電點(diǎn)回收蛋白質(zhì)試驗(yàn)條件優(yōu)化

將試驗(yàn)得到的上清液稱為蛋白溶液。在6個(gè)燒杯中分別取100 mL 蛋白溶液，利用2 mol/L的硫酸溶液調(diào)節(jié)其pH值，依次為1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5，然后于-4 ℃冰箱靜置1.5 h，將靜置后的蛋白溶液于8 000 rpm下離心20 min，得到的上清液過(guò)0.45 μm濾膜，取部分濾液分別進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，剩下的濾液再分別通過(guò)纖維素透析袋(截留分子量20 000 Da)純化備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 熱堿預(yù)處理參數(shù)的確定

如圖1(a)所示，隨著pH值的升高，溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，在pH為12～13區(qū)間顯著增加。當(dāng)pH=13時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最大值2 515.55 mg/L(考慮到堿性過(guò)高對(duì)污泥處理實(shí)際意義不大，較高pH值會(huì)使污泥產(chǎn)生大量褐變反應(yīng)[23]，使其中小分子發(fā)生聚集，預(yù)處理效果反而會(huì)降低，故將pH=13設(shè)為最大值)。這說(shuō)明當(dāng)pH<12時(shí)，污泥細(xì)胞的溶解程度不高，當(dāng)pH>12時(shí)，污泥溶胞率明顯上升。在高溫的協(xié)助作用下，強(qiáng)堿可以與細(xì)胞中的脂類物質(zhì)發(fā)生皂化反應(yīng)[24]，加速破壞污泥中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，強(qiáng)堿具有化學(xué)和電離的雙重作用，更容易使污泥中的微生物細(xì)胞發(fā)生溶解，進(jìn)而使胞內(nèi)物質(zhì)溶出[25]，故選取pH值為13為最佳堿強(qiáng)度。

如圖1(b)所示，熱堿處理中蛋白質(zhì)濃度隨著溫度的升高而逐漸升高，在140 ℃時(shí)達(dá)到最大值1 810.87 mg/L，當(dāng)溫度超過(guò)140 ℃后，蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢(shì)。熱堿處理過(guò)程中，隨著溫度的升高，污泥中的微生物絮體結(jié)構(gòu)開(kāi)始分散，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)也在高溫的作用下溶解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量有機(jī)物溶出。大分子蛋白質(zhì)也在高溫作用下變成小分子蛋白質(zhì)，使溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高[26]。與此同時(shí)，在堿性條件下，過(guò)高的溫度會(huì)使蛋白質(zhì)水解為氨基酸，β-氨基酸是其主要成分，而β-氨基酸在高溫條件下會(huì)發(fā)生脫氨反應(yīng)，生成氨氣和不飽和羧酸鹽，在強(qiáng)堿條件下，氨氣會(huì)從溶液中溢出故溶液中溶解性蛋白質(zhì)的濃度會(huì)降低[27]。

圖1(c)所示為熱堿預(yù)處理時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響，熱堿處理前期，溶液中蛋白質(zhì)濃度隨時(shí)間逐漸增加，在處理時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到最大值2 068.46 mg/L，后期隨著時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)濃度緩慢下降。這是因?yàn)樵跓釅A反應(yīng)中胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和蛋白質(zhì)的水解是同時(shí)進(jìn)行的，在前1.5 h，參照Fan等[28]的試驗(yàn)結(jié)論，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放速率大于蛋白質(zhì)的堿性水解作用，故蛋白質(zhì)濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，1.5 h后，蛋白質(zhì)的水解速率大于胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出速率，故蛋白質(zhì)濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。Li等[29]的研究結(jié)果表明，堿破解污泥細(xì)胞的過(guò)程分為快速和慢速階段，大部分的胞內(nèi)有機(jī)物質(zhì)會(huì)在前30 min被釋放出來(lái)，因此，考慮到經(jīng)濟(jì)和溶胞效果，選取1.5 h為最佳預(yù)處理時(shí)間。

圖1 熱堿提取中pH值、溫度及時(shí)間與溶液中 蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系Fig.1 pH value, temperature and time in relation to protein concentration in solution during the

以上3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定了熱堿處理的最優(yōu)條件為：pH值13、時(shí)間1.5 h、溫度140 ℃，與預(yù)設(shè)條件存在相應(yīng)誤差，可能是因?yàn)槲勰嘈再|(zhì)和試驗(yàn)條件的差異?？紤]到試驗(yàn)誤差情況，取三者蛋白質(zhì)最大濃度的平均值，即熱堿預(yù)處理在最佳條件下可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2 062.98 mg/L。

3.2 超聲-堿聯(lián)合預(yù)處理參數(shù)的確定

由圖2(a)可知，在超聲聯(lián)合堿預(yù)處理污泥時(shí)，堿的強(qiáng)度至關(guān)重要。當(dāng)pH<12時(shí)，隨著堿強(qiáng)度的增加，溶液中蛋白質(zhì)濃度不斷增加，在pH值為12時(shí)達(dá)到最大值488.73 mg/L，當(dāng)pH>12時(shí)，蛋白質(zhì)濃度開(kāi)始下降。因?yàn)槌暡ň哂衅茐奈勰嘈躞w結(jié)構(gòu)的作用，當(dāng)聲波能量達(dá)到一定值時(shí)，污泥絮體結(jié)構(gòu)分散，加大污泥顆粒與堿的接觸面積，提高堿對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用，堿性越強(qiáng)對(duì)污泥的溶胞效果越明顯[30]。但在超聲作用下，堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)加快溶液中部分有機(jī)物的分解，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)含量降低。

圖2(b)顯示，在預(yù)處理時(shí)間為30 min、pH值為12的條件下，當(dāng)功率為1 W/mL時(shí)，蛋白質(zhì)濃度達(dá)到388.35 mg/L，當(dāng)功率繼續(xù)增加至4 W/mL時(shí)，蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，但當(dāng)功率為5 W/mL時(shí)，蛋白質(zhì)濃度迅速增加至最大值497.89 mg/L，后期隨著功率的增加，蛋白質(zhì)濃度再次呈下降趨勢(shì)。超聲波在聯(lián)合堿預(yù)處理時(shí)，主要憑借其空化作用[31](通過(guò)剪切液體形成空化核)和聲化學(xué)作用[32](通過(guò)超聲波加速反應(yīng)的進(jìn)行或產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì))達(dá)到溶胞的目的。在功率由1 W/mL增加到4 W/mL的階段，蛋白質(zhì)濃度降低的原因可能是污泥絮體粒徑過(guò)大，堿未能很好地發(fā)揮作用，超聲功率的增加反而加快了蛋白質(zhì)的水解速率。超聲與堿聯(lián)合作用時(shí)存在最適功率和最佳粒徑的說(shuō)法[33]，只有污泥經(jīng)過(guò)一定功率的超聲后，在剪切作用下分散成最佳粒徑大小，這時(shí)堿才能發(fā)揮其最大破壞作用使細(xì)胞內(nèi)容物流出。試驗(yàn)證明了5 W/mL為該試驗(yàn)條件下的最優(yōu)功率。

如圖2(c)所示，當(dāng)時(shí)間小于30 min時(shí)，蛋白質(zhì)濃度隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，30 min時(shí)達(dá)到499.48 mg/L，30 min以后蛋白質(zhì)濃度趨于平穩(wěn)。在試驗(yàn)前期，超聲波和堿同時(shí)起作用，加速了污泥絮體結(jié)構(gòu)的分解和細(xì)胞壁的破碎，促使蛋白質(zhì)濃度不斷增加。但反應(yīng)持續(xù)一段時(shí)間后，一方面由于堿的消耗導(dǎo)致堿性下降，未能起到跟初期相同的堿解作用，另一方面超聲波單獨(dú)作用時(shí)破解細(xì)胞需要的能量更大，隨著堿解作用的降低，單獨(dú)的超聲作用只能破壞很小一部分污泥細(xì)胞，導(dǎo)致后期蛋白質(zhì)濃度不再有明顯增加[34]。

圖2 超聲聯(lián)合堿提取中pH值、功率及時(shí)間與溶液中 蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系Fig.2 pH value,power and time in relation to protein concentration in solution during the ultrasonic-alkali

試驗(yàn)結(jié)果確定了超聲聯(lián)合堿預(yù)處理的最佳條件為：pH值12、功率5 W/mL、時(shí)間30 min。相同地，考慮到試驗(yàn)誤差取三者蛋白質(zhì)最大濃度的平均值，即在超聲聯(lián)合堿預(yù)處理的最優(yōu)作用條件下可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到497.76 mg/L。

3.3 溶菌酶預(yù)處理參數(shù)的確定

在酶濃度為200 mg/g、時(shí)間為6 h的條件下，在pH值跨度4～9的條件下試驗(yàn)研究了pH值的單獨(dú)作用效果，同時(shí)，以相同pH值跨度研究溶菌酶的作用效果，兩者的差值即為溶菌酶單獨(dú)作用時(shí)的效果。如圖3(a)差值變化曲線所示，當(dāng)pH值等于7時(shí)，酶單獨(dú)起作用時(shí)溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到241.06 mg/L，且高于其他任何pH值下的濃度。pH值是影響溶菌酶水解污泥的一個(gè)重要因素，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)對(duì)酶發(fā)揮其最大活性產(chǎn)生影響。酶分子在不同的pH值溶液中具有不同解離狀態(tài)，固定的某種解離狀態(tài)只能與一種底物結(jié)合酶活性才能達(dá)到最高。除此之外，pH值也會(huì)影響酶分子中某些基團(tuán)的解離，酶底物的專一性、酶分子活性中心的構(gòu)象等都會(huì)影響這些基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的活性[35]。

圖3 溶菌酶提取中pH值、酶濃度及時(shí)間與溶液中 蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系Fig.3 pH value, enzyme concentration and time in relation to protein concentration in solution

如圖3(b)所示，當(dāng)酶濃度較低時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)濃度隨著酶濃度的增高而增高，后期隨著酶濃度的增高，蛋白質(zhì)濃度增加趨勢(shì)較為平緩。當(dāng)溶菌酶濃度為200 mg/g時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最高值297.14 mg/L。這是因?yàn)殡S著前期酶濃度的增加，底物開(kāi)始與酶接觸反應(yīng)，促使大量的有機(jī)物質(zhì)由固相轉(zhuǎn)移到液相中，使得溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高。但當(dāng)反應(yīng)體系中所有底物與所投加溶菌酶充分接觸后，底物幾乎已全部與酶分子結(jié)合形成絡(luò)合物[36]，故當(dāng)酶量增加時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)濃度不再顯著增加。

如圖3(c)所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于6 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸增加，在6 h時(shí)達(dá)到271.65 mg/L，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于6 h時(shí)，蛋白質(zhì)濃度呈明顯降低的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間是酶發(fā)揮活性的一個(gè)重要因素，只有當(dāng)在酶與底物充分接觸，充分反應(yīng)之后，污泥才能最大程度地釋放其內(nèi)含物，進(jìn)而使得溶液中蛋白質(zhì)濃度上升。在反應(yīng)的前6 h內(nèi)，在外界振蕩和恒溫條件下，酶與剩余污泥不斷反應(yīng)，使得污泥被水解并釋放出大量胞內(nèi)物，導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)濃度上升，當(dāng)大于6 h后，溶菌酶已與底物充分接觸反應(yīng)，此時(shí)蛋白質(zhì)的水解速度大于其釋放速度，進(jìn)而溶液中蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢(shì)。

由以上3個(gè)因素影響試驗(yàn)確定溶菌酶預(yù)處理的最優(yōu)條件為：pH值7、酶濃度200 mg/g，時(shí)間6 h，在最優(yōu)作用條件下，可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到269.95 mg/L。

通過(guò)對(duì)3種方法的結(jié)果對(duì)比，得出熱堿法(2 062.98 mg/L)>超聲聯(lián)合堿法(497.76 mg/L)>溶菌酶法(269.95 mg/L)，故選取熱堿法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生部分變性，但不影響后期對(duì)提取蛋白質(zhì)粘度特性[37]，故暫時(shí)不用考慮蛋白質(zhì)變性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.4 溶菌酶對(duì)提取后蛋白質(zhì)的影響結(jié)果

如圖4所示，A、B、C、D、E、F分別代表提取蛋白質(zhì)溶液分別與0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL的溶菌酶溶液混合得到的蛋白質(zhì)濃度理論值與實(shí)際值。由圖4可以看出，理論值與實(shí)際值差距很小，幾乎可以忽略，溶菌酶對(duì)提取蛋白質(zhì)濃度幾乎無(wú)影響。溶菌酶的作用機(jī)制主要是針對(duì)細(xì)胞壁上的肽聚糖，通過(guò)肽鍵上的活性部位水解切斷N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁的作用，對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有破壞作用，這與試驗(yàn)得出的結(jié)論一致[38]。

圖4 熱堿處理提取蛋白質(zhì)溶液與不同濃度溶菌酶 溶液混合后蛋白質(zhì)濃度的理論值與實(shí)踐值Fig.4 Theoretical and practical values of protein concentration after thermal-alkali treatment with different concentration of lysozyme

3.5 等電點(diǎn)回收蛋白質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果

圖5顯示了由熱堿法提取的上清液采用等電點(diǎn)法回收蛋白質(zhì)隨pH值的影響，蛋白質(zhì)回收率隨pH值的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為3時(shí)，蛋白質(zhì)的回收率達(dá)到最大值62.42%。蛋白質(zhì)是由多種氨基酸連接而成的生物大分子，兩性電解質(zhì)，在偏酸和偏堿溶液中會(huì)分別帶正電和負(fù)電。通過(guò)調(diào)節(jié)pH值的大小可破壞或削弱分子表面的水化膜和雙電層，使分子間引力增加，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度，變?yōu)槌恋砦龀鯷39]。Hwang等[5]發(fā)現(xiàn)，在pH值為3.3時(shí)城市污泥蛋白質(zhì)回收率最高，其結(jié)論與本研究相符。

圖5 熱堿處理后污泥固體量和溶液中溶解性蛋白質(zhì) 的變化及pH值對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.5 Changes in sludge solids and soluble protein of solution after thermal-alkali pretreatment and effect of pH on protein recovery

4 結(jié)論與展望

采用熱堿法、超聲-堿聯(lián)合法、溶菌酶法分別對(duì)剩余污泥進(jìn)行預(yù)處理，得出最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件，對(duì)比提取效率可看出：熱堿法(pH值13、溫度140 ℃、時(shí)間1.5 h，2 062.98 mg/L)>超聲聯(lián)合堿法(pH值12、功率5 W/mL、時(shí)間30 min，497.76 mg/L)>溶菌酶法(pH值7、酶濃度200 mg/g、時(shí)間6 h，269.95 mg/L)，對(duì)熱堿法提取的上清液采用等電點(diǎn)法回收蛋白質(zhì)，在pH值為3時(shí)蛋白質(zhì)的回收率最高，為62.42 %。

剩余污泥中的蛋白質(zhì)具有較大的利用潛能，但目前蛋白質(zhì)的提取方法仍存在能耗大、二次污染等問(wèn)題，許多技術(shù)和應(yīng)用環(huán)節(jié)還不夠成熟，仍需要不斷完善。因此，在剩余污泥蛋白質(zhì)的提取及應(yīng)用上還可開(kāi)展大量的研究工作。