高俊卿程仙送王麗麗

（1.陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，陜西 西安710068； 2.西安航天總醫(yī)院兒科，陜西 西安710100）

急性腦卒中是糖尿病最常見(jiàn)的腦血管病變，我國(guó)患者約25%～30%因其而死亡［1?2］，同時(shí)罹患急性腦血管病變的幾率約為正常人群的4～5 倍，嚴(yán)重威脅其生命安全［3］。復(fù)方川參膠囊為陜西省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，用于治療糖尿病合并腦卒中，臨床療效良好，該制劑的制備工藝主要為醇提、水提、生藥粉入藥，但未見(jiàn)對(duì)其活性成分進(jìn)行研究的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方川參膠囊中羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 的含量，以期對(duì)該制劑質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 材料

1.1 儀器 Prominence?i LC?2030C 3D 高效液相色譜儀，配置自動(dòng)進(jìn)樣器、LC／Labsoluion 色譜工作站（日本島津公司）；ME235S 電子分析天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司）；KQ?5200DE 數(shù)控超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 對(duì)照品（純度98.0%，寶雞市晨光生物科技有限公司）。復(fù)方川參膠囊（批號(hào)190104、190105、190106，0.4 g／粒）由陜西省人民醫(yī)院藥劑科制備。甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Honeywell 公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水［由Millipore 純水儀（美國(guó)Millipore 公司）制備］。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［4］ 報(bào)道。Intersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（含1.0 g／L 磷酸）（B），梯度洗脫（0～10 min，95%～90% B；10～40 min，90%～80% B；40～65 min，80%～70% B；65～100 min，60%～30%B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm（細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、人參皂苷Re、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rb2）、321 nm（阿魏酸、羥基紅花黃色素A）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品羥基紅花黃色素A 9.00 mg、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷4.50 mg、阿魏酸5.00 mg、人參皂苷Re 3.20 mg，人參皂苷Rg1 4.28 mg、人參皂苷Rb1 3.54 mg、人參皂苷Rb2 3.28 mg，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 參考文獻(xiàn)［5］ 報(bào)道。取本品20 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱取4 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 70% 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備缺川芎、缺紅花、缺人參、缺遠(yuǎn)志的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.01、0.05、0.20、0.04、0.80、1.0 mL，分別置于1 mL量瓶中，70% 甲醇定容至1 mL，編號(hào)Ⅰ～Ⅵ，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以該成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度良好，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性強(qiáng)。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅲ，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2峰面 積 RSD 分別為 1.21%、0.97%、1.02%、0.88%、1.12%、1.13%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅲ，于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 峰面積RSD 分別為1.26%、1.06%、1.22%、1.37%、1.11%、1.19%、0.88%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)190104）4 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 含量RSD 分別為0.854 2%、1.269 2%、1.301 8%、1.278 6%、0.988 9%、1.191 9%、1.030 5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取本品（批號(hào)190104，羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.753 6、2.262 5、0.524 4、0.512 2、0.252 4、0.562 2、0.202 3 mg／g）2 g，平行9 份，加入對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 平均加樣回收率分別為97.97%、98.40%、97.89%、97.56%、98.22%、97.08%、99.08%，RSD分別為1.22%、1.00%、0.69%、0.84%、1.03%、1.07%、0.94%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取3 批本品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 討論

復(fù)方川參膠囊由川芎、人參、紅花、當(dāng)歸、地龍、遠(yuǎn)志、冰片7 味中藥組成，方中川芎、當(dāng)歸含有阿魏酸［6］，對(duì)慢性腦缺血等有保護(hù)作用［7?8］；人參主要成分人參皂苷［9］具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞作用［10?13］；紅花及其成分羥基紅花黃色素A能有效治療缺血性腦卒中［14?16］；冰片能預(yù)防局灶性腦缺血［17］；遠(yuǎn)志及其成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷有抗癡呆、抗衰老等作用［18?19］；地龍可改善神經(jīng)功能受損程度［20］。糖尿病已被證實(shí)為腦卒中獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［21］，故本實(shí)驗(yàn)選擇上述成分作為檢測(cè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，依據(jù)各成分色譜峰的面積值與分離度（≥1.5），確定阿魏酸、羥基紅花黃色素A 檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 為203 nm；中藥復(fù)方成分眾多，溶解性也不同，等度洗脫難以充分處理，故采用梯度洗脫；比較了Intersil C18、Agilent SB?C18、Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)Intersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）較理想；比較了流動(dòng)相乙腈?水（含0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0 g／L 醋 酸）、乙 腈?水（含0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0 g／L 磷酸）、甲醇?水、乙腈?水，發(fā)現(xiàn)乙腈?水（含1.0 g／L 磷酸）洗脫效果最強(qiáng)，并且其目標(biāo)峰分離度與保留時(shí)間符合要求；比較了不同柱溫、體積流量、記錄時(shí)間，發(fā)現(xiàn)柱溫超過(guò)或低于35 ℃時(shí)目標(biāo)峰分離度小或不能分開(kāi)，體積流量高于或低于0.8 mL／min時(shí)目標(biāo)峰分離度差；記錄時(shí)間在100 min 后無(wú)色譜峰出現(xiàn)。最終確定，柱溫為35 ℃，體積流量為0.8 mL／min，記錄時(shí)間為100 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方川參膠囊中羥基紅花黃色素A、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 的含量，該方法重復(fù)性好，回收率高，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法，并能為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。