朱佳敏 付 莉 吳躍開 張 序

(1.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005；3.修文縣谷堡鎮(zhèn)林業(yè)站，貴州 修文 550213)

荔波唇柱苣苔(Chiritaliboensis)屬苦苣苔科唇柱苣苔屬多年生草本植物，為貴州特有，僅產(chǎn)于荔波縣境內(nèi)，其花色彩艷麗，葉形葉色較好，觀賞價(jià)值很高，可作盆栽花卉、園林綠化植物等[1-2]。作為新開發(fā)的花卉品種，目前對其研究方向多集中在扦插繁殖技術(shù)等方面[3-4]；隨著人工規(guī)?；耘啵蟛ù街奶Σ∠x害問題日益突顯，其中表現(xiàn)最嚴(yán)重的就是黑斑病。該病主要危害荔波唇柱苣苔的葉片，感病后感病部位會產(chǎn)生黑褐色的病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑遍布整個(gè)葉片，造成葉片焦枯、卷曲，甚至整株枯死。目前，荔波唇柱苣苔黑斑病的病原尚未明了，相關(guān)研究還是空白。有鑒于此，本文通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段對荔波唇柱苣苔黑斑病的致病病原菌進(jìn)行了鑒定，以期為今后的病害防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分離材料：病原分離材料采自貴州省貴陽市惠水縣苗圃基地發(fā)病的荔波唇柱苣苔植株。

采集時(shí)間：2019年6月。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，121℃ 滅菌30min。

試劑-及儀器：PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA提取試劑盒、引物ITS1/ITS4(均購于生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 荔波唇柱苣苔黑斑病發(fā)病癥狀觀察

在苗圃中對荔波唇柱苣苔感病植株進(jìn)行詳細(xì)觀察，記錄病害危害狀況、危害部位、危害癥狀等；室內(nèi)在解剖鏡下觀察病斑上是否存在相關(guān)病征(子實(shí)體)。

1.3 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法分離病葉。采集的新鮮病葉用清水沖洗干凈，再用75%乙醇消毒10min，用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干多余水分。在超凈工作臺上對組織進(jìn)行分離，從病健交界處切取5mm×5mm的組織塊于PDA培養(yǎng)基上，28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，待菌絲長出后用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，直至出現(xiàn)單一菌落，觀察記錄生長相似的菌落形態(tài)及顏色。將分離得到的菌落進(jìn)一步純化，并將菌落接種PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的致病性鑒定

分離得到菌落形態(tài)相似的菌株8株，隨機(jī)選擇菌株LBJT1、LBJT3、LBJT4進(jìn)行致病性驗(yàn)證。將各測試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)9d，培養(yǎng)出分生孢子(圖2，F(xiàn))，用無菌水沖洗分生孢子，將孢子配制成107個(gè)/mL的懸液。采集新鮮健康的荔波唇柱苣苔12株，每個(gè)處理3株，設(shè)無菌水為空白對照3株，接種時(shí)，先將植株葉片清洗干凈后用75%乙醇消毒，然后用無菌水沖洗；用無菌接種針刺傷葉片，每株葉片3個(gè)傷口，將制好的孢子懸液用移液槍注入孔內(nèi)。對照也采用相同方法，所有的處理植株置于室內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察記錄發(fā)病情況，待發(fā)病后從發(fā)病組織處再次分離純化病原菌，驗(yàn)證感病菌與原接種菌是否一致。

1.5 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

1.5.1 病葉上病原菌形態(tài)觀察

將發(fā)病的葉片進(jìn)行保濕培養(yǎng)一周后，在解剖鏡及顯微鏡下觀察病斑上是否有病原菌的菌體結(jié)構(gòu)，包括分生孢子梗、分生孢子等的形態(tài)特征，并測量其大小。

1.5.2 培養(yǎng)形狀觀察

將分離純化的病原菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28℃培養(yǎng)5～10天后觀察菌落形態(tài)學(xué)特征?？上热庋塾^察形態(tài)特征，然后在顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)并測量其大小。參閱相關(guān)專著《真菌分類學(xué)》[5]、《中國真菌志》[6]，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6 病原菌 rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增與序列

用真菌DNA提取試劑盒(上海生工)對病原菌的總DNA進(jìn)行提取，并用通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5μL、10mM dNTP0.5μL、10μM引物各0.5μL、模板DNA1μL、Taq酶0.3μL、加ddH2O至總體積25μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min、94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化切膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上利用BLAST與GenBank上已經(jīng)發(fā)表的基因進(jìn)行同源性對比，并與GenBank中已登錄代表性菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA6.0系統(tǒng)發(fā)育軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔波唇柱苣苔黑斑病癥狀觀察

調(diào)查結(jié)果表明，大棚中荔波唇柱苣苔小苗和大苗都易感染黑斑病，感病株率達(dá)90%，感病指數(shù)達(dá)56.25。病菌常從葉緣開始侵染并逐漸向內(nèi)擴(kuò)展成不規(guī)則的大型病斑；病菌亦可從葉中間位置開始侵染，這種情況下病斑常呈環(huán)狀。病斑褐色至深褐色，常具波紋或輪紋，邊緣具黃色暈圈(如圖1)。隨著病程的不斷發(fā)展，病斑最終可擴(kuò)散至全葉，導(dǎo)致葉片枯死，甚至全株枯亡。保濕條件下，病斑上可見長出灰黑色的絨毛，此即為病原菌的分生孢子梗及分生孢子(如圖2-E)。

圖1 荔波唇柱苣苔黑斑病感病植株癥狀

2.2 病原菌的培養(yǎng)特征

對病株的病健交界處進(jìn)行組織分離，獲得8個(gè)純培養(yǎng)菌株，其菌落形態(tài)與生長速度基本一致，菌落圓形，初為白色絨毛狀，邊緣整齊，后菌落內(nèi)圈顏色加深，正面灰褐色，背面褐色，并呈現(xiàn)明顯的環(huán)狀輪紋，分生孢子梗單生，淡褐色，屈膝狀彎曲，具隔膜。分生孢子鏈分支，分生孢子短鏈生，倒棍棒形，卵形或近橢圓形，淡褐色，表面光滑，具3～7個(gè)橫膈膜，大小為18.32～61.37μm×8.44～19.18 μm，短喙柱狀，淡褐色，長為2.70 μm～28.38 μm(圖2)。綜合上述特點(diǎn)，將病原菌鑒定為Alternariaalternata。

A:PDA培養(yǎng)基菌落正面；B:PDA培養(yǎng)基菌落背面

2.3 病原菌的致病性測定

選擇菌株LBJT1、LBJT3、LBJT4進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，接種7d后，60%的傷口處出現(xiàn)半徑約0.1cm的褐色圓形；14d后，75%的傷口處均為直徑0.5cm的褐色斑紋，形成不規(guī)則的水漬狀病斑(圖2，G)，感病率為75%，清水對照的植株無發(fā)病癥狀(圖2，H)。分離并純化感病組織的病原物，得到與原菌株相同的病原菌。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

以菌株LBJT1和LBJT2的DNA為模板，用真菌的通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送去測序，把測序的序列提交到NCBI上進(jìn)行同源性比對，得到分離的菌株與(MG890315Alternariaalternata)的同源性為99%，并從Genbank上下載相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的研究。通過進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析(圖3)，可以看出進(jìn)化樹分為兩枝，一枝為鏈格孢屬的，另一枝為外群葡萄座腔菌屬，供試菌株 LBJT1和LBJT2與Alternariaalternata均聚為一簇，所以進(jìn)一步證實(shí)分離的菌株為Alternariaalternata。

圖3 使用鄰位連接法基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

從具有典型病癥的病株上分離病原菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列比對、致病性接種試驗(yàn)等研究結(jié)果的綜合分析，明確了引起荔波唇柱苣苔黑斑病的病原菌為細(xì)交鏈孢菌(Alternariaalternata(Fr.)Keissler)。此前，相關(guān)研究表明該病原菌能引起多種植物的黑斑病，如月季、藍(lán)莓、核桃、牡丹、生菜、三七、大豆、櫻桃等[7-14]，這是首次在荔波唇柱苣苔上發(fā)現(xiàn)該病原菌，通過此次黑斑病病原菌的準(zhǔn)確鑒定，可為該病害以后的防治提供可靠的依據(jù)。