尹逗逗 方銀軍 劉雪鋒

(1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇無錫，214000；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州，310030)

氨基酸表面活性劑是一類以可再生物質(zhì)為原料的環(huán)境友好型表面活性劑，具有低毒、易生物降解的優(yōu)點[1-3]，且皮膚刺激性小[4-5]，配伍性能好[6-8]，與脂肪酸皂相比具有更好的硬水穩(wěn)定性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于日用化學(xué)品配方中[9-12]。工業(yè)上大多以肖頓-鮑曼縮合法合成氨基酸表面活性劑[13-15]，生產(chǎn)過程中難以避免酰氯的水解，而產(chǎn)物純度對應(yīng)用性能有直接的影響，因此，建立其純度分析方法對氨基酸表面活性劑的品質(zhì)控制和應(yīng)用具有重要的意義。

陰離子型的氨基酸表面活性劑在分子結(jié)構(gòu)上與脂肪酸相近，屬于羧酸類化合物，須在堿性條件下才能抑制水解。為確保滴定的準確性，應(yīng)選擇適用于堿性條件的指示劑滴定。似乎可以采用適用于皂類表面活性劑的溴甲酚綠堿性兩相滴定法[16-17]進行陰離子型氨基酸表面活性劑的定量分析。本文以N-月桂?；K氨酸(C12Thr)為例，對其進行溴甲酚綠兩相滴定法純度分析。在滴定過程中發(fā)現(xiàn)乳化嚴重、破乳困難，嚴重干擾了滴定終點的判斷。進而，采用高效液相色譜(HPLC)法(示差折光檢測器)對C12Thr樣品進行了定量分析。相比兩相滴定法，HPLC法更為直觀、快速和簡便。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N-月桂?；K氨酸，自制；溴甲酚綠，AR，上海化學(xué)試劑總廠試劑三廠；十二水磷酸氫二鈉，AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水磷酸鈉，AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；海明1622，97 %，北京伊諾凱科技有限公司；甲醇，HPLC，阿達瑪斯試劑有限公司；月桂酸，RG (99%以上)，阿達瑪斯試劑有限公司。Agilent 1100型高效液相色譜儀 (示差折光檢測器) ，美國安捷倫公司；KQ-100B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩相滴定分析

分別以海明1622和CTAB(濃度均為4.00×10-3mol·L-1)為滴定劑、以溴甲酚綠為指示劑進行兩相滴定分析[16-17]。預(yù)先用NaOH中和C12Thr得到N-月桂?；K氨酸鈉(C12ThrNa)試樣，配制100 mL 1.00×10-2mol·L-1的試液溶液。移取10 mL試樣溶液于100 mL具塞量筒中，并向其加入指示劑25 mL、氯仿15 mL和1.00 mol·L-1NaOH溶液1 mL，滴定間隙劇烈振搖，滴定過程中上層藍色開始轉(zhuǎn)移至下層，記錄所加滴定劑的體積V1；放慢滴加速度至上層藍色完全轉(zhuǎn)移至下層時，記錄所加滴定劑的體積V2；繼續(xù)滴定至兩相立即破乳，記錄所加滴定劑的體積V3。平行滴定3次，取平均值?？瞻讓嶒灴捎^察到兩相立即破乳，藍色快速完全轉(zhuǎn)移至油相，記錄所加滴定劑的體積V0。

試樣中陰離子表面活性劑的質(zhì)量分數(shù)x為：

式中，c為陽離子滴定劑的濃度(mol·L-1)，Vi分別為V1、V2和V3，其中，V1為滴定過程中油相出現(xiàn)藍 色時滴定劑的體積(mL)，V2為滴定過程中上層藍色完全轉(zhuǎn)移至下層時滴定劑的體積(mL)，V3為兩相立即破乳時滴定劑的體積(mL)，V0為空白實驗所消耗的滴定劑體積(mL)，M為待測表面活性劑的摩爾質(zhì)量(g·mol-1)，m為待測表面活性劑的質(zhì)量 (g)。

1.2.2 HPLC分析

(1) 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18反相柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；檢測器：示差折光檢測器；流動相：甲醇 (超聲脫氣) ；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：40 μL。該色譜條件下可實現(xiàn)C12Thr和LA兩者之間基線分離。

(2) C12Thr和LA的工作曲線和最低檢測限

以色譜甲醇為溶劑分別配制一系列不同濃度的C12Thr和LA溶液，得到色譜流出曲線，繪制C12Thr和LA的色譜峰面積(A)與濃度(c, g·L-1)關(guān)系圖，確定線性范圍[18-19]。將試樣溶液按梯度稀釋，將S/N(信噪比) = 3時所對應(yīng)的濃度作為檢測限[20]。

(3) 精密度和空白加標回收實驗

取一定濃度的C12Thr和LA溶液，分別連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，并計算其 RSD 值。按照線性范圍內(nèi)低、中、高3種濃度，向空白樣品中加入待測物質(zhì)，每個樣品測3次，記錄峰面積，取平均值。

加標回收率 ＝ 試樣測定值/理論值×100 %。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩相滴定

兩相滴定是根據(jù)兩相顏色變化來判斷滴定終點，進而計算表面活性劑純度或含量的一種方法。在滴定過程中，滴定劑首先與待測物在水中發(fā)生定量化學(xué)反應(yīng)，形成難溶于水的陰陽離子締合物進入油相；達到等當點后，過量的滴定劑與指示劑締合使水相顏色轉(zhuǎn)移至油相，即可判為滴定終點[16-17,21]。我們發(fā)現(xiàn)海明1622滴定C12ThrNa的過程中產(chǎn)生明顯的乳化現(xiàn)象(見圖1)。

分別在滴定至氯仿相剛出現(xiàn)藍色和水相顏色全部轉(zhuǎn)移至氯仿相時進行了觀察，當海明1622滴定至氯仿相剛出現(xiàn)藍色時，乳化體系靜置 2.5 h后僅有少許油相析出（見圖1a），兩天后體系仍未完全破乳，此時C12ThrNa的滴定含量僅約為76%（見表1）；繼續(xù)滴定至氯仿相顏色明顯加深、乳化層顏色明顯消退 (這個現(xiàn)象需要約17 h方可清楚觀察到，圖1b)，體系中的乳化現(xiàn)象依然嚴重，靜置48 h后才觀察到完全破乳，此時水相的藍色全部轉(zhuǎn)移至氯仿相（見圖1b），此時C12ThrNa的滴定含量約為90%（見表1）；繼續(xù)滴定至體系 1 min內(nèi)破乳，此時C12ThrNa的滴定含量約為 98%（見表1）。

考慮到C12ThrNa的親水基體積較大，而海明1622分子結(jié)構(gòu)中存在兩個乙氧基(EO)基團，有可能導(dǎo)致海明1622與C12ThrNa形成的陰陽離子締合物具有明顯的兩親性，進而導(dǎo)致明顯的乳化現(xiàn)象。為排除海明1622分子結(jié)構(gòu)中EO基團可能帶來影響，選擇用CTAB作為滴定劑再次進行滴定分析。出乎意料的是，用CTAB滴定時體系中嚴重的乳化現(xiàn)象依然存在(滴定數(shù)據(jù)見表1)，說明該乳化現(xiàn)象并非完全由海明1622分子結(jié)構(gòu)上的EO基團所致。

圖1 以海明1622滴定C12ThrNa

表1 C12ThrNa的兩相滴定數(shù)據(jù)結(jié)果

由此推測：C12ThrNa的親水頭基過大，與陽離子表面活性劑的締合過程有較明顯的空間位阻效應(yīng)，使得C12ThrNa與滴定劑形成的陰陽離子締合物具有明顯的兩親性，致使滴定過程中尤其是臨近滴定終點時產(chǎn)生明顯的乳化現(xiàn)象，嚴重干擾了滴定終點的判斷。

值得指出的是，這種乳化現(xiàn)象可以通過局部滴加短鏈醇或添加中性強電解質(zhì)無機鹽等方法予以破乳，但是面臨著導(dǎo)致滴定分析結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差的風險。

2.2 HPLC法

為簡便處理，采用以C12Thr為分析樣進行HPLC色譜條件建立和具體分析。采用甲醇為流動相，Hedera ODS-2 C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱。流動相流速為0.6 mL ·min-1時，LA和C12Thr可實現(xiàn)基線分離(見圖2)。 其中，LA的保留時間t約為9.66 min，C12Thr的保留時間t約為7.53 min；在LA-C12Thr混合樣中，LA和C12Thr的保留時間t與單獨樣相比沒有明顯的偏移，兩者之間實現(xiàn)很好的基線分離。與前文所述兩相滴定法相比，HPLC法可以在15 min內(nèi)很好地分離LA和C12Thr，極大地減少了檢測時間；不僅如此，兩相分析法所得結(jié)果為總陰離子表面活性劑含量，而HPLC法可以更加精準地得到可能存在的原料酸和目標氨基酸表面活性劑的具體含量。

圖2 LA與C12Thr的HPLC流出曲線圖

以質(zhì)量濃度c為橫坐標，流出曲線峰面積A為縱坐標繪制工作曲線(圖3)，進行線性回歸分析。如圖3a所示，LA的濃度在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1范圍內(nèi)時，峰面積A與濃度c之間存在良好的線性關(guān)系，其線性方程為：A＝2.14×105c＋4.43×102，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9993；如圖3b所示，C12Thr的線性范圍濃度為：6.07×10-2～1.62 g·L-1，線性方程為：A＝2.41×105c＋1.98×103，R2為0.9985。

圖3 LA (a) 和 C12Thr (b) 的工作曲線

根據(jù)S/N(信噪比)＝3時所對應(yīng)的待測樣濃度[20]，得出LA和C12Thr的檢測限分別為4.12×10-3g·L-1和4.32×10-3g·L-1，說明該方法具有較好的靈敏度。

用上述方法對實驗實際合成所得C12Thr的含量分析結(jié)果見表2。由于缺乏標準樣，C12Thr的面積歸一化含量為(99.27±0.08)%。采用外標法[18-19,22]檢測到樣品中LA含量為(1.02±0.11)%，進而得出C12Thr含量為(98.98±0.11)%，所得結(jié)果與兩相滴定法(見表1) 比較接近。

表2 C12Thr的含量 %

表3 LA和C12Thr的精密度測試

表4 LA和C12ThrNa的加標回收實驗

LA和C12Thr的精密度測試結(jié)果見表3，LA和C12Thr樣品的RSD均小于2%，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好。

LA和C12Thr的空白加標實驗結(jié)果見表4，LA的空白加標回收率為(99.47±0.16)%，RSD為0.14%；而C12Thr的空白加標回收率為(99.55±0.18)%，RSD為0.16%。可見，加標回收實驗結(jié)果較好。

3 結(jié)論

綜上所述，建立了一種可快速同時檢測C12Thr及其原料酸LA含量的HPLC分析方法。研究發(fā)現(xiàn)C12Thr線性范圍為6.07×10-2～1.62 g·L-1，檢測限為4.12×10-3g·L-1，空白加標回收率為99.55±0.18%；LA的線性范圍在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1之間，檢測限為4.32×10-3g·L-1，空白加標回收率為(99.47±0.16)%。與傳統(tǒng)的兩相滴定法相比，HPLC法所用試劑種類少、無需使用有毒溶劑、靈敏度較高，并極大地縮短了檢測時間，整個檢測過程可在15 min內(nèi)完成。該分析流程的建立方法可為相關(guān)氨基酸表面活性劑生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和生產(chǎn)工藝監(jiān)控提供借鑒。