林曉，孫傳茹，王彩霞，練森，董向麗，李保華

影響蘋果樹腐爛病菌侵染致病的流行因子

林曉，孫傳茹，王彩霞，練森，董向麗，李保華

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109

【】腐爛病是蘋果樹的重要枝干病害，主要造成死枝、死樹。論文旨在明確低溫等環(huán)境因子和枝條齡期等寄主因子對(duì)腐爛病菌（）侵染致病的影響，分析腐爛病流行成災(zāi)的原因，為腐爛病的流行預(yù)測(cè)和防控提供依據(jù)。通過人工控制環(huán)境條件下的接種試驗(yàn)，檢測(cè)腐爛病菌在蘋果枝干各部位的定殖率，觀測(cè)腐爛病菌在傷口內(nèi)的定殖部位，測(cè)試低溫冷凍、枝條浸水后冰凍、枝條失水、枝條齡期等因子對(duì)接種腐爛病菌侵染致病的影響。8月份用分生孢子噴霧接種的蘋果樹，次年3月份檢測(cè)，7個(gè)枝位的帶菌率都接近或超過90%；接種到傷口上的腐爛病菌主要定殖于傷口壞死組織內(nèi)，并在死組織內(nèi)生長擴(kuò)展，但沒有穿透傷口外圍的愈傷木栓層而侵入活體的皮層組織致?。辉跈z測(cè)的6個(gè)枝位中，新鮮傷口對(duì)腐爛病菌侵染致病最為敏感，接種發(fā)病率最高，果柄痕次之，叉丫、芽眼和果苔枝的敏感性稍差，發(fā)病率稍低，皮孔抗病性最強(qiáng)，接種病菌不能致?。坏蜏乩鋬龊徒蟊鶅觯ㄖl上形成冰晶）都能增加枝條芽眼部位對(duì)接種腐爛病菌的感病性，其中-25和-18℃兩個(gè)溫度下處理枝條的接種發(fā)病率顯著高于-10、-7和0℃ 3個(gè)溫度處理枝條的接種發(fā)病率，浸水后冰凍枝條（模擬冬季降水后結(jié)冰的枝條）的接種發(fā)病率顯著高于相同溫度處理未結(jié)冰枝條的發(fā)病率；在低溫冷凍和浸水后冰凍處理的枝條中，一年生枝條的接種發(fā)病率顯著高于二年生枝條的發(fā)病率；一年生枝條經(jīng)浸水冰凍處理后，梢部的接種發(fā)病率顯著高于同一枝條基部的發(fā)病率；浸水后冰凍再經(jīng)失水處理枝條（模擬枝條越冬后因大風(fēng)、高溫等失水），對(duì)腐爛病菌的侵染致病更加敏感，接種發(fā)病率顯著高于浸水后冰凍枝條的發(fā)病率，而且失水量越大，接種發(fā)病率越高，芽眼部位的接種發(fā)病率最高可達(dá)85%。腐爛病菌易在蘋果枝干上定殖，定殖病菌主要在傷口或枝干表層死組織內(nèi)存活并生長，定殖病菌能否侵染致病關(guān)鍵取決于環(huán)境因子對(duì)枝條栓皮層的破壞；低溫冷凍，尤其低于-15℃的低溫凍害能破壞枝條的栓皮層和皮層，增加蘋果枝條對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性；與低溫冷凍相比，浸水后冰凍對(duì)枝條栓皮層的破壞作用更大，結(jié)冰枝條對(duì)腐爛病更加敏感；枝條浸水冰凍后再失水，對(duì)枝條的破壞作用尤為嚴(yán)重，枝條越冬后失水能顯著增加其對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性；枝條的齡期不同，栓皮層的發(fā)育成熟度、強(qiáng)度和韌度各不相同，受不良環(huán)境因子的影響后，其受到破壞的程度也不同；樹體不同部位栓皮層的結(jié)構(gòu)不同，對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性也存在明顯差異。

蘋果樹腐爛??；皮層結(jié)構(gòu)；腐爛病菌；病菌定殖；病菌侵染；冷凍；結(jié)冰；失水

0 引言

【研究意義】腐爛病是東亞地區(qū)蘋果樹上的重要枝干病害，造成死枝、死樹和毀園。自解放初期，腐爛病在中國已大規(guī)模流行4次，對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重打擊[1-3]。目前，腐爛病仍然是蘋果樹的主要病害，而且有加重危害的趨勢(shì)[4-6]。從病害流行角度出發(fā)，研究病原、寄主、溫度、濕度等因子對(duì)腐爛病流行的影響，并分析其在病害流行中的作用，可為蘋果樹腐爛病的流行預(yù)測(cè)和防控提供參考。【前人研究進(jìn)展】蘋果樹腐爛病由侵染所致[7-10]。研究表明，腐爛病菌可由內(nèi)和外兩條途徑侵入寄主的活體皮層而致病。從剪鋸口侵入的腐爛病菌，能侵入枝干的木質(zhì)部，在木質(zhì)部內(nèi)長期存活，并沿導(dǎo)管生長擴(kuò)展至枝干內(nèi)部[11-14]，于侵染后第2、3年，甚至更長的時(shí)間，病菌從木質(zhì)部由內(nèi)向外擴(kuò)展到達(dá)皮層，產(chǎn)生毒素和細(xì)胞壁降解酶[15-17]，殺死皮層組織，導(dǎo)致皮層發(fā)病[17-18]。蘋果枝干發(fā)生腐爛病后，病菌也能從發(fā)病皮層進(jìn)入木質(zhì)部，并在其中生長擴(kuò)展，次年病菌從木質(zhì)部由內(nèi)向外生長擴(kuò)展，導(dǎo)致舊病斑復(fù)發(fā)。由內(nèi)向外擴(kuò)展致病的病原菌受外界環(huán)境因子的影響小[14]。除由內(nèi)向外生長擴(kuò)展致病外，腐爛病菌還能在枝干表層死組織內(nèi)定殖，定殖于枝干表層死組織內(nèi)的腐爛病菌也能由外向內(nèi)侵入活體的寄主皮層組織而致病，導(dǎo)致皮層、叉丫、芽眼、果苔枝等部位發(fā)病。腐爛病菌孢子從在枝干上萌發(fā)定殖到侵入活體皮層致病，常需要很長時(shí)間，這一現(xiàn)象稱為潛伏侵染[19-20]。處于潛伏期的腐爛病菌主要以腐生方式在死組織內(nèi)生長、擴(kuò)展或休眠，并以腐生方式長期存活。在已發(fā)生過腐爛病的蘋果園內(nèi)，枝干表層常潛伏有大量腐爛病菌[21]，病菌主要在剪鋸口、傷口、果苔枝、芽眼和表皮等部位的死組織內(nèi)潛伏[19,21]。定殖于枝干表層和死組織內(nèi)的病菌難以直接穿透木栓層侵入活體皮層組織致病[22-24]，其侵染致病受寄主組織結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子的影響，病菌只有在特定的條件下才能侵染致病，且發(fā)病高峰期主要出現(xiàn)在春季蘋果樹萌芽期前和秋季的9—10月[4,20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前的研究認(rèn)為，定殖于蘋果枝干表層死組織內(nèi)的腐爛病菌能否侵入活體的皮層誘發(fā)腐爛病，關(guān)鍵取決于腐爛病菌能否穿透蘋果枝干表層的保護(hù)層，即栓皮層。蘋果枝干因低溫冷凍、日灼、物理傷害、生物傷害等因子的影響受到破壞后，而樹體又因休眠、受損等原因不能及時(shí)愈傷抑制病菌的侵染致病時(shí)，就近潛伏的腐爛病菌趁機(jī)侵入活體的皮層組織，導(dǎo)致腐爛病的發(fā)生。枝干發(fā)育不良，栓皮層發(fā)育不完善，會(huì)加重環(huán)境因子的危害。然而，目前還缺少有力的組織學(xué)證據(jù)證實(shí)上述觀點(diǎn)，而且有關(guān)環(huán)境因子對(duì)腐爛病發(fā)病與流行的數(shù)量影響及影響機(jī)制的研究報(bào)道很少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測(cè)試低溫冷凍、枝條結(jié)冰、枝條失水、枝條成熟度等因子對(duì)腐爛病菌侵染致病和發(fā)病嚴(yán)重度的影響，明確不同因子對(duì)腐爛病發(fā)病程度的影響，一方面為腐爛病發(fā)病嚴(yán)重度的預(yù)測(cè)和流行防控提供依據(jù)，另一方面為更深入的理解潛伏病菌侵染與致病機(jī)制提供旁證。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與蘋果枝條

2016年3月從山東棲霞的富士蘋果園內(nèi)采集腐爛病枝條，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）組織分離后，用直徑0.8 mm的毛細(xì)管從菌落外圍打取單條菌絲的末端，轉(zhuǎn)入新的PDA平板中培養(yǎng)5—7 d，獲得純化菌株。用離體枝條接種測(cè)定其致病力后，選取致病力強(qiáng)的菌株作為供試菌株，并保存于3—5℃冰箱內(nèi)。接種前轉(zhuǎn)入PDA中活化3—5 d，從菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，用于接種。

將菌餅接種到蜂蜜水和蛋白胨浸泡過的大麥粒中，培養(yǎng)15 d，誘發(fā)產(chǎn)生分生孢子器[25]。接種前，挑取已產(chǎn)生分生孢子器的大麥粒放到1%的水瓊脂內(nèi)保濕，25℃恒溫箱中培養(yǎng)2—3 d，誘發(fā)孢子器釋放分生孢子角。挑取新鮮的分生孢子角，置于純凈水中，制成濃度為106個(gè)/ml的孢子懸浮液，用于噴霧接種。

試驗(yàn)用樹為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)園內(nèi)3—5年生的栽盆蘋果樹，品種為煙富3，砧木為M9T337。試驗(yàn)前從盆栽樹上剪取基部直徑為0.5—1 cm的當(dāng)年生、一年生或二年生的健康枝條，截成20 cm長的枝段，用于接種試驗(yàn)。

1.2 噴霧接種樹體的帶菌率及腐爛病菌在傷口內(nèi)的潛伏部位

2016年8月份，選擇3株生長良好、健康、枝條較多的三年生盆栽富士蘋果樹，用小鋼鋸在每株樹的當(dāng)年生枝條上，鋸出30—50個(gè)傷口，其中一半的傷口深度達(dá)木質(zhì)部，另一半僅破壞表皮層。將造傷的蘋果樹移到造霧玻璃溫室內(nèi)，用手持噴霧器將新配制的孢子懸浮液噴霧接種整株蘋果樹的枝干上，直到孢子懸浮液流下為止。樹體接種后，打開霧化噴頭，將接種樹體在溫室內(nèi)保濕24 h。保濕期間，溫室內(nèi)的溫度為15—25℃。接種后，將樹體移到室外自然條件下，按常規(guī)措施管理，不噴施殺菌劑。次年3月份，以每株樹為一個(gè)重復(fù)，從樹體的叉丫、枯死樁、果苔枝、隱芽、傷口（兩種傷口，每種各取5塊組織）、多年生枝條皮孔、一年生枝條皮孔7個(gè)枝位，取長和寬各為5 mm皮層組織各10塊，在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)液（PDB）中浸泡20 min，轉(zhuǎn)入蘋果枝條離體皮層的內(nèi)面，包扎后保濕培養(yǎng)5—7 d，檢測(cè)離體皮層是否發(fā)生腐爛病，從而判斷被檢測(cè)組織塊是否定殖有腐爛病菌[26]。

為了觀測(cè)腐爛病菌在傷口組織內(nèi)的潛伏部位，次年3月切取上一年用分生孢子接種的各種傷口組織30塊，用冷凍切片機(jī)切成20—40 μm厚的組織切片，經(jīng)透明和熒光染色后，制成臨時(shí)玻片，在Leica DM2500萬能顯微鏡下，以365 nm的紫外光作激發(fā)光源，觀察腐爛病菌在傷口組織內(nèi)的分布，并選取典型視野照相。

1.3 樹體不同枝位對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性

選取三年生健康無病的蘋果樹10株，用腐爛病菌的菌餅接種一年生和二年生枝條上的芽眼、皮孔、叉丫、果（柄）痕、果苔（枝）、新造傷口6個(gè)枝位，每個(gè)枝位在10株樹上共接種20個(gè)點(diǎn)。新造傷口為用小鋼鋸鋸出的橫向傷口，深達(dá)木質(zhì)部。接種時(shí)，將菌餅直接貼到接種部位，菌絲貼近寄主組織，接種后用拉伸膜包扎固定。接種4周后，解去包扎膜，檢查接種點(diǎn)是否發(fā)病，計(jì)算每個(gè)枝位上接種點(diǎn)的發(fā)病率。只有當(dāng)接種部位出現(xiàn)長度超過5 mm的紅褐色典型腐爛病潰瘍病斑時(shí)，認(rèn)為接種點(diǎn)發(fā)病。全部試驗(yàn)于2017年2—3月重復(fù)3次，每次重復(fù)中間間隔1—2周。

1.4 低溫冷凍與浸水后冰凍對(duì)接種腐爛病菌侵染致病的影響

為了模擬冬季低溫冷凍和降水后枝條結(jié)冰對(duì)腐爛病菌侵染致病的影響，試驗(yàn)設(shè)置枝條浸水和不浸水兩個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)溫度，分別為-25、-18、-10、-7和0℃，全部試驗(yàn)共10個(gè)組合，每個(gè)組合10個(gè)枝條。5個(gè)溫度由5個(gè)冰箱控制。

剪取一年生富士蘋果枝條，剪成20 cm長的枝段，隨機(jī)選擇發(fā)育良好、粗度一致的枝段50支，分成2組，每組25支。其中，一組置于清水中浸泡2 h，從水中取出后，再隨機(jī)分為5組，每組5支，帶水轉(zhuǎn)入5個(gè)不同溫度的冰箱中進(jìn)行冰凍處理；另一組，不經(jīng)清水浸泡，與清水浸泡的枝條一起放入5個(gè)冰箱，進(jìn)行冷凍處理。所有枝條在冰箱中處理24 h后取出，在室內(nèi)自然溫度下放置1 h，待枝條完全解凍，并晾干表面水分后，每個(gè)枝段選取5個(gè)隱芽，接種腐爛病菌菌餅。接種時(shí)，讓菌絲面緊貼芽眼，用拉伸膜包扎，標(biāo)記，放入密封的塑料箱內(nèi)，箱底加少量清水，保持100%的相對(duì)濕度。將塑料箱轉(zhuǎn)入25℃的恒溫箱中保濕培養(yǎng)5 d，檢查接種點(diǎn)是否發(fā)生腐爛病。全部試驗(yàn)在12月至1月份重復(fù)3次。

1.5 枝條齡期對(duì)接種腐爛病菌侵染致病的影響

2—3月份，剪取長度超過70—90 cm的一年生枝條，從樹體上剪下，剪除基部5 cm和梢部5 cm的枝段，取基部、中部和梢部各20 cm的枝段。將所有枝段在清水中浸泡2 h，分別轉(zhuǎn)入-25、-7和0℃冰箱中處理24 h，每個(gè)溫度處理基部、中部、梢部枝段各5支。處理結(jié)束，從冰箱中取出處理枝段，室溫下放置1 h后接種腐爛病菌菌餅，每個(gè)枝段接種5個(gè)芽眼。接種枝條在25℃保濕培養(yǎng)5 d后，檢查接種點(diǎn)是否發(fā)病。全部試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 枝條失水對(duì)接種腐爛病菌侵染致病的影響

剪取一年生富士蘋果枝條，剪成20 cm長的枝段，選取發(fā)育良好、粗度一致的枝段105枝，在水中浸泡2 h，隨機(jī)分成3組，分別轉(zhuǎn)入-25、-7和0℃冰箱中處理24 h。處理結(jié)束后，在室溫下放置1 h，待枝條完全解凍后，轉(zhuǎn)入通風(fēng)條件良好的地方，放置2、6、12、24、36、48和72 h后，分別從每組枝條中隨機(jī)取5支，接種腐爛病菌菌餅。每個(gè)枝段接種5個(gè)芽眼，接種后用保鮮膜包扎，置于相對(duì)濕度為100%的塑料盒中，轉(zhuǎn)入25℃下培養(yǎng)5 d，檢查每個(gè)接種點(diǎn)是否發(fā)病。全部試驗(yàn)在2—3月份重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

以每個(gè)部位、每個(gè)枝條帶菌率或接種點(diǎn)的發(fā)病率為基本數(shù)據(jù)單位，計(jì)算平均值和方差。將帶菌率和發(fā)病率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，用新復(fù)極差法比較各處理的差異顯著性，數(shù)據(jù)分析在R內(nèi)完成（V3.6.2）。

2 結(jié)果

2.1 接種樹體不同枝位的帶菌率及傷口內(nèi)病菌的潛伏部位

次年3月，在用分生孢子懸浮液噴霧接種的富士蘋果樹切取210塊皮層組織檢測(cè)，其中189塊潛帶有腐爛病菌，病組織上潛伏的病菌能誘發(fā)離體的蘋果皮層形成典型的腐爛病癥狀。7個(gè)不同枝位的帶菌率無顯著差異（＞0.05，表1）。經(jīng)過連續(xù)兩年的觀察，接種樹體上沒有發(fā)現(xiàn)腐爛病斑。

次年3月，切取傷口組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)傷口外圍已形成由2—5層木栓化細(xì)胞構(gòu)成的愈傷木栓層。木栓層內(nèi)為黑色壞死的組織，內(nèi)有黃綠色的菌絲，為腐爛病菌的菌絲（圖1-A）。菌絲主要在木栓層隔離出的壞死組織內(nèi)生長擴(kuò)展，沒有穿過寄主的木栓層。在30個(gè)傷口組織的數(shù)千個(gè)組織切片觀察中，沒有發(fā)現(xiàn)能突破木栓層的菌絲（圖1-B）。

2.2 樹體不同枝位對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性

春季2—3月份，用腐爛病菌菌餅接種的蘋果樹的6個(gè)不同枝位，接種點(diǎn)的發(fā)病率存在顯著差異（＜0.05）。新造傷口接種發(fā)病率最高，49個(gè)接種點(diǎn)發(fā)病率為30.6%，顯著高于其他枝位的發(fā)病率（＜0.05）。果柄痕的發(fā)病率次之，51個(gè)接種點(diǎn)的發(fā)病率為15.6%。腐爛病菌不能誘發(fā)皮孔發(fā)病，58個(gè)接種點(diǎn)中，都沒有發(fā)現(xiàn)腐爛病斑，發(fā)病率為0。叉丫、芽眼和果苔枝3個(gè)枝位的發(fā)病率分別為3.7%、3.8%和3.6%，三者之間無顯著差異（＞0.05，圖2）。

2.3 低溫冷凍和枝條浸水后冰凍對(duì)接種病菌侵染致病的影響

冷凍和枝條浸水后冰凍對(duì)蘋果枝條的接種發(fā)病率均有顯著影響（＜0.05）。在接種點(diǎn)發(fā)病率的總方差中，溫度和浸水對(duì)應(yīng)的方差分別占總方差的34.0%和8.3%。在5個(gè)處理溫度中，-25和-18℃下處理枝條的發(fā)病率最高，60個(gè)枝條300個(gè)接種點(diǎn)的發(fā)病率為29.3%和34.0%，顯著高于（＜0.05）其他溫度處理枝條接種點(diǎn)的發(fā)病率；0℃處理枝條的發(fā)病率最低，為3.7%，顯著低于（＜0.05）其他溫度處理枝條的接種發(fā)病率。經(jīng)清水浸泡2 h后再冰凍處理的枝條，接種點(diǎn)的發(fā)病率為26.0%，顯著高于（＜0.05）未經(jīng)浸水而相同溫度下冷凍處理的枝條的發(fā)病率15.1%（表2）。所有處理中，一年生枝條的接種發(fā)病率為26.7%，顯著高于（＜0.05）二年生枝條的接種發(fā)病率14.4%。

2.4 枝條齡期對(duì)接種病菌致病的影響

同一條一年生的富士蘋果枝條的不同段位，經(jīng)浸水冰凍處理后再接種腐爛病菌，其接種點(diǎn)的發(fā)病率存在顯著差異（＜0.05）。在-25℃下處理48 h的枝條，再接種菌餅，梢部接種點(diǎn)的最高發(fā)病率達(dá)45.3%，3個(gè)處理溫度下的平均發(fā)病率為24.0%，顯著高于（＜0.05）中部段位的平均發(fā)病率12.9%。枝條基部的平均發(fā)病率為7.1%，顯著低于（＜0.05）梢部的發(fā)病率，但與中部的發(fā)病率無顯著差異（＞0.05）。3個(gè)處理溫度中，-25℃下處理的枝條發(fā)病率最高，為24.9%，顯著高于其他兩個(gè)溫度的處理。-7和0℃兩個(gè)溫度處理枝條接種點(diǎn)的發(fā)病點(diǎn)率為11.1%和8.0%，二者無顯著差異（＞0.05）（表3）。

柱上不同字母表示不同枝位的接種發(fā)病率在α=0.05水平差異顯著

2.5 枝條失水對(duì)接種病菌侵染致病的影響

富士蘋果一年生枝條浸水冰凍后，再置于室內(nèi)自然條件下（溫度為20℃左右）自然失水，失水處理時(shí)間越長，失水量越大，接種病菌后的發(fā)病率越高。失水處理72 h枝條，接種點(diǎn)最高發(fā)病率為85.3%，45個(gè)枝條的225個(gè)接種點(diǎn)的平均發(fā)病率為62.2%，顯著高于（＜0.05）其他失水時(shí)間處理的接種發(fā)病率。失水處理48和36 h的枝條，平均發(fā)病率分別為31.6%和33.3%，顯著低于（＜0.05）72 h的處理，但高于（＜0.05）其他失水處理。失水處理2 h的枝條，接種發(fā)病率為6.2%，顯著低于（＜0.05）其他失水處理。-25、-7和0℃3個(gè)溫度處理的枝條失水后的接種發(fā)病率分別為37.5%、22.3%和17.9%，三者之間存在顯著差異（表4）。

表2 不同齡期富士蘋果枝條經(jīng)低溫冷凍和浸水后冰凍處理后再接種腐爛病菌的發(fā)病率

同一行或同一列中的不同字母表示發(fā)病率在=0.05水平差異顯著。下同

Different letters in the same column and row indicate that the disease incidences were significant difference at=0.05 level. The same as below

表3 富士蘋果一年生枝條不同段位經(jīng)浸水冰凍處理后再接種腐爛病菌的發(fā)病率

表4 富士蘋果枝條經(jīng)浸水冰凍和失水處理后再接種腐爛病菌的發(fā)病率

3 討論

8月份用腐爛病菌分生孢子懸浮液噴霧接種的蘋果樹，次年3月份檢測(cè)，不同枝位皮層組織的帶菌率接近或超過90%，與PCR的檢測(cè)結(jié)果一致[21]，枝條上的潛伏病菌都能誘發(fā)蘋果枝干的離體皮層發(fā)生腐爛病。然而，樹體的帶菌數(shù)量與枝干的發(fā)病率相差甚遠(yuǎn)，大量的潛伏病菌并沒有誘發(fā)腐爛病。組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果表明，接種到傷口內(nèi)腐爛病菌主要在傷口死組織擴(kuò)展或休眠，在大量觀察中沒有發(fā)現(xiàn)能突破傷口外圍愈傷木栓層而侵入活體皮層組織的腐爛病菌。目前，對(duì)于腐爛病菌在寄主表皮層內(nèi)潛伏的確切部位還不清楚。根據(jù)病菌在傷口組織內(nèi)生長擴(kuò)展，可以推測(cè)腐爛病菌主要潛伏于蘋果枝干表層的死組織內(nèi)，但無法穿透寄主的栓皮層侵入活體組織致病。離體條件下對(duì)腐爛病菌有較好抑制效果的殺菌劑[27-30]和生防菌株[29-33]，在活體條件下難以鏟除樹體潛伏的腐爛病菌，說明腐爛病菌在枝干表層的潛伏部位較深。潛伏于枝干表層死組織內(nèi)的腐爛病菌只有在特殊的條件下，栓皮層受到破壞時(shí)，才能侵入活體皮層組織致病[22]。本試驗(yàn)中，噴霧接種后24 h的保濕就能使腐爛病菌的分生孢子在枝干上大量定殖，自然條件下能夠使病菌孢子傳播和萌發(fā)的降雨，應(yīng)該能使腐爛病菌在蘋果枝干上定殖。

樹體不同枝位的接種結(jié)果表明，傷口的接種發(fā)病率最高，其次果柄痕，叉丫、芽眼和果苔枝發(fā)病率相對(duì)較低，而接種到皮孔的病菌不能致病，發(fā)病率為0，這與自然條件下各部位的發(fā)病率基本一致[3,19-20]。該結(jié)果從側(cè)面證實(shí)腐爛病菌的侵染致病與枝條栓皮層的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。蘋果樹干表面的木栓層是枝干的保護(hù)層，枝條受傷，栓皮層受到破壞，腐爛病菌趁機(jī)侵入活體皮層組織而致病，導(dǎo)致傷口發(fā)病。造傷對(duì)皮層的破壞最嚴(yán)重，傷口發(fā)病率也最高。富士蘋果的果柄痕，愈傷栓皮層結(jié)構(gòu)不完善，不能阻止腐爛病菌的侵染，接種發(fā)病率也較高。芽眼處枝條與隱芽結(jié)合部栓皮層存在裂隙，也容易受到破壞；叉丫處的栓皮層皺褶多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，受風(fēng)力、重力等因素的影響，極易撕裂；果苔枝與正常枝條不同，其皮層厚而組織疏松，栓皮層易受破壞。自然條件下，3個(gè)部位都是腐爛病的高發(fā)部位。皮孔及周圍的皮層發(fā)育良好，結(jié)構(gòu)完整，腐爛病菌難以突破結(jié)構(gòu)完好的栓皮層而致病，除非栓皮層因凍害、日灼、損傷而受到破壞。

低溫冷凍一方面破壞枝條的栓皮層，另一方面破壞皮層的活體組織，導(dǎo)致皮層組織死亡或受損，枝條不能及時(shí)愈傷，潛伏病菌趁機(jī)侵入活體皮層組織而致病。本研究也表明，低溫凍害降低了枝條芽眼處對(duì)腐爛病菌的抗性，提高了腐爛病菌的接種發(fā)病率。另外還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)清水浸泡過2 h后再冰凍的枝條對(duì)腐爛病菌更加敏感，接種發(fā)病率顯著高于相同溫度冷凍而結(jié)冰的枝條。其可能的原因是，浸水后冰凍在枝條上形成的冰晶對(duì)栓皮層的破壞作用更大，誘發(fā)的病害也更重。枝條浸水冰凍后再經(jīng)失水處理，皮層的失水皺縮對(duì)栓皮層的破壞作用更大，腐爛病菌的接種發(fā)病率更高。失水處理72 h的枝條，接種發(fā)病率高達(dá)85.3%。在所有處理枝條中，一年生枝條的接種發(fā)病率高于二年生枝條，一年生枝條梢部的接種發(fā)病率高于基部，表明環(huán)境因子對(duì)腐爛病侵染致病的影響與枝條的發(fā)育成熟度密切相關(guān)。枝條的發(fā)育成熟度低，栓皮層薄弱，其強(qiáng)度和韌性差，受不良環(huán)境因子的影響后，更容易遭受破壞。低溫冷凍等因子對(duì)腐爛病菌的生長和存活也有一定的影響，但與其對(duì)枝條栓皮層的破壞相比，其對(duì)病原菌的影響可以忽略。

低溫冷凍、冬季降雨后枝條結(jié)冰、春季溫度回升或遇大風(fēng)后枝條失水皺縮（嚴(yán)重失水時(shí)，會(huì)導(dǎo)致枝條枯死，稱為抽條）是果園內(nèi)常見的自然現(xiàn)象。低于-15℃的低溫，會(huì)導(dǎo)致蘋果樹形成凍害，破壞枝干的栓皮層和皮層的活體細(xì)胞[19-20]。冬季降雨或降雪后的低溫會(huì)導(dǎo)致樹體表面結(jié)冰，尤其是易積水部位，如翹皮縫隙內(nèi)、側(cè)芽與枝條的夾縫、叉丫等部位，浸水后冰凍形成的冰晶對(duì)栓皮層的破壞作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過同一溫度的低溫所造成的破壞。枝條失水會(huì)導(dǎo)致枝條皮層收縮變形，嚴(yán)重破壞枝條栓皮層的結(jié)構(gòu)。3個(gè)自然因子對(duì)蘋果枝條栓皮層形成的破壞都會(huì)為定殖于枝干表層死組織內(nèi)腐爛病菌的侵染致病提供便捷的孔口，而樹體或枝條生長發(fā)育不良加重了環(huán)境因子的危害，這些因子都是誘發(fā)腐爛病的重要因子，也是預(yù)測(cè)春季腐爛病發(fā)病嚴(yán)重度的重要預(yù)測(cè)因子。除上述因子，蘋果生長季節(jié)的降雨是腐爛病菌傳播和在枝干上定殖的必要條件，秋季高溫干旱也會(huì)造成枝條失水和枝干表層的結(jié)構(gòu)變化，這些因子與腐爛病菌侵染致病之間的關(guān)系還不清楚。

腐爛病菌容易在蘋果枝干上定殖[11-12,21]，定殖在蘋果枝干表層的腐爛病菌能夠越冬，且能長期存活。定殖病菌能否致病關(guān)鍵取決環(huán)境因子對(duì)枝干栓皮層的破壞程度。腐爛病菌在枝干表層死組織內(nèi)及在枝干木質(zhì)部易于定殖，且能長期存活的生物學(xué)特性，導(dǎo)致腐爛病菌在果園內(nèi)逐年積累，使腐爛病成為典型的積年流行病害。當(dāng)一個(gè)果園內(nèi)有能產(chǎn)生孢子的腐爛病斑，遇到適宜于病菌定殖、侵染和致病的環(huán)境條件和/或管理措施時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腐爛病菌在果園內(nèi)大量繁殖、傳播、蔓延、定殖、侵染和致病，使病原菌在果園內(nèi)快速積累，若病菌的快速積累得不到有效抑制，病菌經(jīng)過3—5年的積累可導(dǎo)致病害的大流行。中國和日本的腐爛病的多次大流行都是由人為管理措施或環(huán)境因子誘發(fā)，經(jīng)3—5年的病原菌積累所導(dǎo)致[2-3]。依據(jù)果園內(nèi)的發(fā)病量、環(huán)境因子的變化及人為管理措施對(duì)病菌定殖、侵染、發(fā)病和產(chǎn)孢的影響，預(yù)測(cè)病害發(fā)生與流行趨勢(shì)，依據(jù)病害的流行預(yù)測(cè)及時(shí)采取防控措施，并保持健旺的樹勢(shì)，阻止病原菌在果園內(nèi)快速積累，是防控腐爛病流行與危害的基本策略。

4 結(jié)論

腐爛病菌易在蘋果枝干上定殖，定殖病菌主要在傷口或枝干表層死組織內(nèi)存活并生長，定殖病菌能否侵染致病關(guān)鍵取決于環(huán)境因子對(duì)枝條栓皮層的破壞；低溫冷凍，尤其低于-15℃的低溫凍害能破壞枝條的栓皮層和皮層，增加蘋果枝條對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性；與低溫冷凍相比，浸水后冰凍對(duì)枝條栓皮層的破壞作用更大，結(jié)過冰的枝條對(duì)腐爛病菌的侵染致病更加敏感；枝條浸水冰凍后再失水，對(duì)枝條的破壞作用尤為嚴(yán)重，枝條越冬后失水能顯著增加其對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性；枝條的齡期不同，栓皮層的發(fā)育成熟度、強(qiáng)度和韌度各不相同，受不良環(huán)境因子的影響后，其受到破壞的程度也不同；樹體不同部位栓皮層的結(jié)構(gòu)不同，對(duì)腐爛病菌侵染致病的敏感性也存在明顯差異。

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Epidemic Factors Affecting the Infection and Occurrence of

LIN Xiao, SUN ChuanRu, WANG CaiXia, LIAN Sen, DONG XiangLi, LI BaoHua

College of Plant Health and Medicine, Qingdao Agricultural University/Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong, Qingdao 266109, Shandong

【】Valsa canker,mainly causing dead branches and dead trees, is an important branch disease of apple trees. The objective of this study is to clarify the impact of environmental factors such as low temperature and host factors such as the age of branches on the infection and occurrence of valsa canker, to analyze the causes of the disease epidemics, and to provide a basis for the prediction and control of the disease.【】Inoculation experiments were conducted under artificial controlled environmental conditions. The conidia colonized ratios ofon different parts of apple branches were detected, the colonization sites of the pathogen in wounds were examined, and effects of the factors such as freezing, ice forming on branches, loss of water of branches, and age of branches on the infection of the pathogen and occurrence of the disease were tested in the experiments.【】The colonized percentages of,the site carried the pathogen, on the 7 different branch sites of the apple trees inoculated with conidial suspension in the August were close to or more than 90% when examined in March of the following year. The pathogen inoculated on the wounds mainly colonized, grew and expanded in the necrotic tissue of the wounds, but did not penetrate the cork layer around the wound and invade the living cortical tissue to cause canker disease. Among the 6 examined branch sites, fresh wounds were the most susceptible to infection of, with the highest disease incidence of inoculated sites, followed by fruit stalk scars. The forks, bud eyes and fruit moss were less susceptible and disease incidences of inoculated sides were slightly lower. The lenticels were resistant to pathogen infection and no inoculated sites developed to canker. Both freezing and freezing after soaking (form ice on branch surface) can increase the susceptibility of branches to infection of. In the tested branches, the disease incidence of inoculated sites on the branches treated at -25 and -18℃were significantly higher than that treated at -10, -7 and 0℃, and the incidence on branches frozen after soaking (simulating branch freezing after precipitation in winter) was significantly higher than that of uniced branches treated at the same temperature. Among the branches that were frozen and frozen after soaking, the disease incidence of inoculated sites on 1-year-old branches was significantly higher than that of 2-year-old branches. The disease incidence of inoculated sites at the tips of 1-year-old branches was significantly higher than that at the base of the same branches when frozen after soaking. The branches subjected to water loss after frozen (simulating the branches that lose water due to wind and high temperature after overwintering) were more susceptible to the infected, and the disease incidence of inoculated sites was significantly higher than that on frozen branches after soaking. The greater the amount of water losing, the higher the disease incidence, and the highest disease incidence of inoculated bud eye can reach 85%.【】is easy to colonize on apple branches, and colonized pathogens mainly survive and grow in dead tissues in wounds or on the surface of branches. Whether colonized pathogens can infect and cause disease mainly depends on environmental factors destroying the cork layer of the branches. Freezing, especially freezing damage at the temperature below -15℃ can destroy the cortex and cork layer of the branches, and increase the susceptibility of apple branches to infection of. Compared with freezing, freezing that form ice crystals on the surface of branches lead to a greater damage to the cork layer of branches, and the branches are more susceptible to the infection of the pathogen. The damage of water loss after freezing to the branches is particularly serious. The loss of water after the branches overwinter can significantly increase susceptibility of the branches to infection of the pathogen. The age of the branches is different, the developmental maturity, strength and toughness of the cork layer are different, and the degree of damage to the cork layer is also different when the branches were affected by adverse environmental factors. The structure of cortex in different sites of the tree is different, and there are obvious differences in the susceptibility to the pathogen infection.

valsa canker of apple tree; cortex structure;; pathogen colonization; pathogen infection; freezing; ice forming; water lose

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.007

2020-08-04；

2020-10-12

國家自然科學(xué)基金（31371883）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0201122）、國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-28，CARS-27）

林曉，E-mail：18363974407@163.com。通信作者李保華，E-mail：baohuali@qau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）