劉 曉,張 廳,唐曉波,馬偉偉,王小萍,李春華,王 云

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,四川成都 610066)

黃茶是我國(guó)六大茶類之一,是一類小眾茶,為我國(guó)所獨(dú)有。按鮮葉原料老嫩可分為黃芽茶、黃小茶和黃大茶三類。其中蒙頂黃芽是黃芽茶中的精品,自古以來(lái)都是宮廷貢茶,產(chǎn)于四川省雅安市名山區(qū)蒙頂山茶區(qū)。黃芽具有干茶黃、湯色黃、葉底黃的特點(diǎn),并有抗氧化[1]、助消化[2]、抑制肝損傷[3-4]等多種保健功能。蒙頂黃芽有著獨(dú)特的悶黃工藝及口感[5],受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞,產(chǎn)銷量持續(xù)增長(zhǎng),黃茶產(chǎn)業(yè)日漸壯大。蒙頂黃芽的相關(guān)研究也越來(lái)越引人關(guān)注。目前,蒙頂黃芽的研究主要集中在加工工藝[6-10]、品質(zhì)化學(xué)成分[11-16]、微生物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[17-18]、生物學(xué)功能[19-20]等,但對(duì)黃茶水溶性成分的定量分析和采用水溶性成分進(jìn)行黃茶的鑒別研究較少。而且,對(duì)黃茶鑒別和品質(zhì)評(píng)判多依賴于感官評(píng)價(jià),缺少能夠量化的指標(biāo)。

表1 供試蒙頂黃芽樣品的來(lái)源信息Table 1 Sources of Mengding yellow bud samples used in this study

本研究搜集四川24個(gè)典型蒙頂黃芽樣品,采用LC-TOF/MS指紋圖譜及定量分析蒙頂黃芽水溶性成分,研究蒙頂黃芽的典型加工工藝特征,并進(jìn)一步利用聚類分析對(duì)蒙頂黃芽樣品進(jìn)行分類,有助于構(gòu)建系統(tǒng)科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化蒙頂黃芽品質(zhì)評(píng)價(jià)體系,為蒙頂黃芽的鑒別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

24個(gè)(S1～S24)蒙頂黃芽樣品 源自四川省的24個(gè)不同生產(chǎn)廠家,所有茶葉樣品的生產(chǎn)年份均為2019年3月,詳見表1,這24個(gè)茶樣有沒(méi)經(jīng)過(guò)悶黃的,有用陳茶炒黃的,有傳統(tǒng)工藝悶黃的,還有采用現(xiàn)代工藝悶黃的;考馬斯亮藍(lán) G-250、95%乙醇、磷酸、濃硫酸、無(wú)水葡萄糖、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、乙二胺四乙酸二鈉、抗壞血酸 成都科龍化工試劑廠;牛血清白蛋白、蒽酮、福林酚 分析純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲酸、甲醇 色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乙酸 成都科龍化工試劑廠;標(biāo)準(zhǔn)品:沒(méi)食子酸(純度≥98%)、表兒茶素(純度≥98%)、表沒(méi)食子兒茶素(純度≥98%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(純度≥98%)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(純度≥98%)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(純度≥98%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;兒茶素(純度≥98.67)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(純度≥99.61%)、沒(méi)食子兒茶素(純度≥99.5%) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;L-谷氨酸(純度≥99%) 日本TCI公司;咖啡堿(純度≥98%) 中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1260型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;1200/6210 型液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;JA2003型電子天平(精度:0.00001 g) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;UV-1700型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;5810R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;BP 211D型電子天平 德國(guó)Sartorius公司;Milli-Q型超純水器 美國(guó)Millipore公司;KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;XW-80A型漩渦混合器 上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官審評(píng)方式 感官審評(píng)根據(jù)茶葉感官審評(píng)方法[21]黃茶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。由5名國(guó)家二級(jí)評(píng)茶員以上資質(zhì)的茶葉審評(píng)專家組成審評(píng)小組,審評(píng)得分為5人評(píng)分的平均值,審評(píng)術(shù)語(yǔ)由主評(píng)綜合5人結(jié)果給出最后評(píng)語(yǔ)。其中外形占25%,湯色占10%,香氣占25%,滋味占30%,葉底占10%。

1.2.2 可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定 參考劉小華等的方法,采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[22]法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 可溶性糖的測(cè)定 參照張正竹[23]主編《茶葉生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》中“實(shí)驗(yàn)2-6”進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 茶多酚含量測(cè)定 參照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[24]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 游離氨基酸酸總量測(cè)定 參照GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[25]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 兒茶素組分和咖啡堿含量的測(cè)定 參照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[24]的前處理方法進(jìn)行制備供試液,并按照如下液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定:

液相色譜柱:Gemini? 5 μm C18 110 A,250 mm×4.6 mm;流動(dòng)相A為0.1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm,柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫方法見表2:

表2 流動(dòng)相的梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.2.7 指紋圖譜的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.2 g粉碎茶樣于50 mL具塞離心管中,加入20 mL 90 ℃的蒸餾水,立即放入90 ℃水浴中浸提20 min,每隔5 min渦旋振蕩10 s。提取完成后,靜置,冷卻至室溫,取1 mL上層清液于12000 r/min下離心8 min,供LC-TOF MS測(cè)定。

LC-TOF/MS測(cè)定色譜條件:

液相色譜柱:Agilent XDB-C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

LC-TOF/MS測(cè)定質(zhì)譜條件:

離子源:電噴霧離子源,正離子模式;霧化器壓力:40 psi;毛細(xì)管電壓:3500 V;干燥氣流量:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;除液電壓:65 V;錐孔電壓:120 V;掃描方式:全掃描。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,然后采用DPS 9.50軟件進(jìn)行因子分析和聚類分析。對(duì)所有蒙頂黃芽樣品進(jìn)行LC-TOF MS分析后,將色譜圖數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《國(guó)家藥典》委員會(huì)發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版),生成四川蒙頂黃芽的LC-TOF/MS共有峰特征指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度(mg/mL)為x軸,峰面積為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到9種水溶性成分對(duì)照品溶液的線性回歸方程,如表3所示。每種對(duì)照品的峰面積與質(zhì)量濃度間的相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說(shuō)明線性關(guān)系良好。

表3 蒙頂黃芽中多種成分色譜蜂面積 與質(zhì)量濃度間的線性回歸方程Table 3 Linear equation between peak areas and concentrations of Mengding yellow bud components

2.2 四川蒙頂黃芽感官品質(zhì)研究

四川蒙頂黃芽樣品的感官審評(píng)結(jié)果見表4。由表中可知,24個(gè)蒙頂黃芽的感官品質(zhì)有非常明顯的差異,在干茶外形方面,蒙頂黃芽的形狀、勻整度等方面差異不大;但在干茶外觀顏色方面,1和4號(hào)以翠綠為主,8、17和21號(hào)以黃為主,其他樣品色澤以嫩黃為主。在內(nèi)質(zhì)湯色方面,12號(hào)嫩黃鮮亮,1、4、14、15、19號(hào)和20號(hào)的湯色以黃綠為主,2、3、5、6、7、8、11、17號(hào)和21號(hào)的湯色以黃為主,23號(hào)和24號(hào)的湯色以淡黃為主,9、10、13、16、18號(hào)和22號(hào)以綠黃為主。在內(nèi)質(zhì)滋味方面,3、6、10、12號(hào)和13號(hào)以鮮醇為主,2、5、7、8、17、18、19、21號(hào) 和22號(hào)以醇和為主,9、11、14、15、16、20號(hào)和24號(hào)以醇厚為主,1號(hào)和4以濃厚為主。在內(nèi)質(zhì)香氣方面,1號(hào)和4號(hào)以栗香為主,2、5、6、7、12、13、15、16、18、19、20、23號(hào)和24號(hào)以甜香為主,3、9、10、11、14號(hào)和22號(hào)以清鮮為主,8、17和21號(hào)帶火功香。在葉底方面,2、12、14、15、16號(hào)和18號(hào)以嫩黃為主,3、5、6、7、8、9、10、11、13、19、20、22、23號(hào)和24號(hào)以黃為主,1號(hào)和4號(hào)嫩綠較亮,8、17號(hào)和21號(hào)黃欠亮。綜合上述,1號(hào)和4號(hào)偏綠茶品質(zhì)特征,8、17和21號(hào)偏陳茶品質(zhì)特征,其他樣品呈現(xiàn)黃茶品質(zhì)特征。24個(gè)樣品感官審評(píng)結(jié)果差異很大,主要是由悶黃工序的有無(wú)及悶黃條件的不同引起。

表4 不同蒙頂黃芽感官審評(píng)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of different Mengding yellow bud

2.3 四川蒙頂黃芽指紋圖譜的構(gòu)建

按照已建立的LC-TOF/MS分析方法,對(duì)24個(gè)不同廠家的24個(gè)蒙頂黃芽樣品進(jìn)行分析,將所得到的色譜圖數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《國(guó)家藥典》(2012.1版)發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),得到蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜,如圖1所示。選擇出峰時(shí)間適中、峰面積在色譜圖中所占比例較大,且在四川蒙頂黃芽樣品中均穩(wěn)定存在的3號(hào)峰作為參照峰,共發(fā)現(xiàn)16個(gè)共有峰,如圖2所示,通過(guò)與對(duì)照品液相譜圖比對(duì),共確定了9種化合物,分別為GC(沒(méi)食子兒茶素)、EGC(表沒(méi)食子兒茶素)、CAF(咖啡堿)、C(兒茶素)、EC(表兒茶素)、EGCG(表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯)、GCG(沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯)、ECG(表兒茶素沒(méi)食子酸酯)與CG(兒茶素沒(méi)食子酸酯)。

圖1 24個(gè)蒙頂黃芽樣品的LC-TOF/MS指紋圖譜Fig.1 LC-TOF/MS fingerprints of 24 Mengding yellow bud samples

2.4 四川蒙頂黃芽水溶性成分的含量分析

按照1.2.6節(jié)中的方法進(jìn)樣10 μL,連續(xù)進(jìn)樣3次,計(jì)算峰面積平均值,根據(jù)相應(yīng)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算各茶葉中8種主要成分的含量,以干質(zhì)量計(jì),如表5所示。1號(hào)、4號(hào)的GC、EGC含量較低,EGCG和ECG含量較高,GC和EGC屬于非酯性兒茶素,收斂性較弱,味醇和不苦澀;EGCG和ECG酯型兒茶素具有強(qiáng)烈收斂性,苦澀味較重,因此1號(hào)和4號(hào)呈現(xiàn)出綠茶的滋味特征;8號(hào)、17號(hào)和21號(hào)的EGCG均較低,8號(hào)最低,可能是因?yàn)樵陉惙胚^(guò)程中EGCG發(fā)生氧化反應(yīng)而減少,與感官審評(píng)結(jié)果一致。不同蒙頂黃芽主要水溶性成分含量與周繼榮等[9]人的研究結(jié)果一致,究其原因是因?yàn)榭酀诟刑卣鞯腅GCG、ECG在悶黃的過(guò)程中水解成醇和口感特征的GC、EGC等。

表5 不同蒙頂黃芽主要水溶性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of major components in different brands of Mengding yellow bud(mg/g)

圖2 蒙頂黃芽水溶性成分共有峰LC-TOF/MS指紋圖譜Fig.2 The common peak LC-TOF/MS fingerprint of water-soluble components of Mengding yellow bud注:1:GC;2:EGC;3:CAF;4:EC;5:C; 6:GCG;7:EGCG;8:ECG;9:CG。

從表6可以看出,采用現(xiàn)代工藝悶黃12號(hào)的茶多酚含量最低,酚氨比低,可溶性糖和氨基酸含量較高,與感官審評(píng)結(jié)果一致;1號(hào)和4號(hào)沒(méi)經(jīng)過(guò)悶黃,茶多酚和咖啡堿含量高,滋味濃厚;8號(hào)、17號(hào)和21號(hào)茶多酚含量均較低,是因?yàn)樵谫A藏過(guò)程中多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)形成兒茶素類；8號(hào)可溶性糖含量較高,可能是在炒黃過(guò)程中多糖類物質(zhì)受高溫作用發(fā)生脫水反應(yīng)分解成可溶性糖；11、15、18、17號(hào)游離氨基酸總量最低,這可能是氨基酸在貯藏的過(guò)程中氧化降解所致[26]。綜上所述,不同蒙頂黃芽主要生化成分分析結(jié)果與感官審評(píng)結(jié)果一致。

2.5 四川蒙頂黃芽樣品的因子分析和聚類分析

表6 不同蒙頂黃芽主要生化成分分析結(jié)果Table 6 Contents of main biochemistry components in different brands of Mengding yellow bud

對(duì)蒙頂黃芽樣品的品質(zhì)成分進(jìn)行因子分析,所得的因子特征值和貢獻(xiàn)率如表7所示。根據(jù)特征值大于1的原則提取了4個(gè)因子,其方差貢獻(xiàn)率分別為33.42%、21.23%、16.97%、8.82%,其所包含的信息量占總體信息量的80.44%,基本反映了大部分變量的信息。

表7 因子分析特征值和貢獻(xiàn)率Table 7 Eigenvalue and contribution rate of factor analysis

通過(guò)對(duì)因子的載荷矩陣旋轉(zhuǎn)之后,可使載荷系數(shù)更接近1,這樣得到的公因子能夠更好的解釋和命名變量[27-28]。對(duì)載荷矩陣進(jìn)行方差極大正交旋轉(zhuǎn),得到因子載荷矩陣方差為0.4568,因子載荷矩陣如表8所示。由表8可知,公因子1累積貢獻(xiàn)率為28.93%,對(duì)應(yīng)特征向量中貢獻(xiàn)最大的是GC、EGC、EC和咖啡堿,其特征向量值均值0.80以上,基本可以代表非酯型兒茶素類和咖啡堿。公因子2累積貢獻(xiàn)率為42.48%,對(duì)應(yīng)的特征向量為ECG、CG和可溶性糖,基本可以代表酯型兒茶素類、蛋白質(zhì)和糖類。公因子3累積貢獻(xiàn)率為61.68%,對(duì)應(yīng)的特征向量中貢獻(xiàn)最大的C、EGCG和茶多酚,基本可以代表茶多酚。公因子4累積貢獻(xiàn)率為75.58%,對(duì)應(yīng)的特征向量為游離氨基酸和酚氨比,基本可代表氨基酸。

表8 因子載荷矩陣Table 8 Rotated component matrix

根據(jù)因子分析的結(jié)果,對(duì)4個(gè)公因子(表8)的品質(zhì)成分采用組間聯(lián)接的聚類方法和平方歐式距離區(qū)間測(cè)量法進(jìn)行聚類分析如圖3。在遺傳距離小于20處(如圖3所示)進(jìn)行聚類分析,可分為4個(gè)大的類群(圖3)。沒(méi)經(jīng)過(guò)悶黃的1、4號(hào)聚為一類;采用現(xiàn)代工藝悶黃的12號(hào)聚為一類;用陳茶炒黃的8、17號(hào)和21號(hào)聚為一類;傳統(tǒng)工藝悶黃的2、3、5、6、7、9、10、11、13、14、15、16、18、19、20、22、23號(hào)和24號(hào)聚為一類。不同黃茶樣品的聚類分析結(jié)果表明,不同加工工藝對(duì)黃茶內(nèi)含化學(xué)成分的影響較大,可利用聚類分析對(duì)我國(guó)不同加工工藝和不同產(chǎn)地的黃茶樣品進(jìn)行初步區(qū)分。

圖3 不同蒙頂黃芽樣品的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Fig.3 Results of systematic cluster analysis of different Mengding yellow bud samples

3 結(jié)論

目前,對(duì)蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)初步構(gòu)建了蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜,結(jié)果顯示,24個(gè)四川蒙頂黃芽樣品均有16個(gè)共有峰,但峰面積存在差異,說(shuō)明不同廠家的四川蒙頂黃芽樣品,由于生產(chǎn)工藝的差異,造成其內(nèi)含化學(xué)成分含量的不同;通過(guò)聚類分析能初步區(qū)分不同工藝的蒙頂黃芽樣品。悶黃是黃茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序,悶黃過(guò)程中的濕熱作用導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的降低,但黃茶作為輕發(fā)酵茶,其品質(zhì)形成機(jī)理可能還有殘余酶類參與多酚類化合物的氧化,本身就存在內(nèi)在的不穩(wěn)定性,這也是黃茶指紋圖譜研究的難點(diǎn),這就需要實(shí)施茶葉的規(guī)范化加工,搜集更多全國(guó)范圍的黃茶,并運(yùn)用聯(lián)用技術(shù)獲得全國(guó)黃茶的特征譜及特征性成分,以更好地對(duì)黃茶物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)利用LC-TOF/MS法構(gòu)建了24個(gè)蒙頂黃芽樣品的LC-TOF/MS指紋圖譜,得到了有關(guān)四川蒙頂黃芽質(zhì)量的綜合信息,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了定量分析,因子分析表明,14個(gè)品質(zhì)成分綜合為4個(gè)公因子,前4個(gè)公因子的特征值大于1且累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)80.44%,主要代表性指標(biāo)為兒茶素類、咖啡堿、蛋白質(zhì)和糖類等,并找到了不同工藝蒙頂黃芽水溶性成分的含量差異;當(dāng)臨界值小于20時(shí),通過(guò)聚類分析將24個(gè)樣品分為4類。LC-TOF/MS指紋圖譜結(jié)合定量分析分離效率高、分析速度快、準(zhǔn)確率高,同時(shí)為蒙頂黃芽提供了量化的鑒定方法,比通過(guò)單一成分測(cè)定得到的結(jié)果更為豐富和全面,具有一定的優(yōu)越性,不僅可應(yīng)用于黃茶質(zhì)量評(píng)價(jià)、黃茶加工工藝全過(guò)程的質(zhì)量控制和最終產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià),還可以應(yīng)用于功能性成分的定性和定量,同時(shí)可以確保黃茶產(chǎn)品質(zhì)量的一致性、安全性及可靠性。本研究結(jié)果在一定程度上為四川蒙頂黃芽品質(zhì)真?zhèn)蔚蔫b定及產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。