顏靜宛　林智敏　周淑芬　陳子強

摘 要：為分析編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白基因Os08PTS在水稻種子發(fā)育中的功能及利用Os08PTS啟動子進行遺傳改良。依據(jù)TDNA插入位點信息，克隆Os08PTS基因啟動子，并利用生物信息學手段分析Os08PTS啟動子的順式作用元件特征，同時構(gòu)建啟動子與GUS融合表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因植株，驗證啟動子的表達特征。結(jié)果表明：Os08PTS基因啟動子片段中包含啟動子的基本元件TATAbox和CAATbox，以及光調(diào)控元件、赤霉素應答元件、生長素反應元件、參與防御和應激反應相關元件等多個與生長發(fā)育或者逆境脅迫相關的順式作用元件，還含有與分生組織表達以及胚乳表達相關元件等。進一步構(gòu)建Os08PTS啟動子的GUS融合載體，并獲得水稻遺傳轉(zhuǎn)化植株。Os08PTS啟動子序列能夠驅(qū)動Os08PTS基因在水稻莖和種子胚的表達，該啟動子具有驅(qū)動下游基因轉(zhuǎn)錄的活性。

關鍵詞：水稻;啟動子;GUS染色

中圖分類號：S 511 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）03-0006-05

水稻是世界上重要的糧食作物之一，水稻胚的發(fā)育直接影響著整個植物體的繁殖和發(fā)育，因此備受研究者的關注。在分子水平上，水稻胚的發(fā)育是眾多基因在外界環(huán)境因子作用下有序表達的結(jié)果。啟動子作為一種重要順式作用調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達調(diào)控中起著重要作用。根據(jù)啟動子驅(qū)動下游基因表達的特點，可分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子三類[1]，其中胚特異性啟動子具有顯著的組織特異性，可以調(diào)控內(nèi)外源基因在植物胚中特異性表達。因此，分離和鑒別水稻胚特異性啟動子不僅有助于了解相關功能基因在胚中的作用，而且利用胚特異性表達啟動子可以使外源目的基因在胚中高效表達，同時避免因外源基因在植物其他部位的過度表達而產(chǎn)生對水稻農(nóng)藝性狀的不良影響。

啟動子捕獲是一種產(chǎn)生大規(guī)模隨機插入突變體庫的有力手段，廣泛應用在細菌、酵母、動物和植物中[2-4]。該方法利用無啟動子驅(qū)動的報告基因隨機插入染色體中，通過檢測報告基因在生物體中的表達與否及表達部位，可以判斷報告基因插入位置附近是否有基因的啟動子存在及其下游基因的表達特性，進而通過報告基因插入位置可以分離出相應的啟動子及其基因。本課題組前期利用本實驗室構(gòu)建的水稻啟動子捕獲突變體庫，獲得1個GUS報告基因在水稻胚中特異表達的突變體W8292，TailPCR分析顯示，該突變體的TDNA插入于1個編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白（PITP）的基因內(nèi)，命名該基因為Os08PTS。

本研究利用TDNA插入位點信息，克隆Os08PTS基因啟動子，并利用生物信息學手段分析Os08PTS啟動子的順式作用元件特征，同時構(gòu)建啟動子與GUS融合表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因植株，驗證啟動子的表達特征，為進一步分析編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白基因Os08PTS在水稻種子發(fā)育中的功能及利用Os08PTS啟動子進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試啟動子克隆材料和供試轉(zhuǎn)基因水稻受體材料均為明恢86。所有材料種植在福州壽山基地內(nèi)。

1.2 主要試劑

Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase高保真酶（諾唯贊公司），限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司）、Golden Easy PCR System、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA 測序（福州尚亞生物技術有限公司），組織培養(yǎng)試劑（Sigma公司），GUS染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 載體和菌株

供試菌株為大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌菌株EHA105，均購于北京博邁德生物有限公司;啟動子載體pCXGUSP為福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室保存。

1.4 Os08PTS啟動子的克隆和生物信息學分析

前期獲得了水稻TDNA插入的基因Os08PTS在NCBI上的序列登錄信息（AP014964.1），根據(jù)Os08PTS基因上游2000 bp的啟動子區(qū)域，對照日本晴基因組序列設計Os08PTS啟動子PCR擴增引物，引物編號及序列為P8292F1：5′gcaggagcccagaaacagca 3′

，P8292R1：5′ctaggttccccgtcttacaggct 3′。通過高保真酶PCR擴增Os08PTS啟動子序列。反應程序為：95℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 2 min，32個循環(huán);72℃，10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖膠進行電泳回收，產(chǎn)物預期大小為2000 bp。把條帶清晰、大小正確的PCR產(chǎn)物送至福州尚亞生物技術有限公司進行測序。

將測序正確的Os08PTS啟動子序列，通過Plant CARE在線分析軟件進行預測，進一步對Os08PTS啟動子的序列進行生物信息學分析，顯示出該序列的啟動子序列特征。

1.5 啟動子與GUS融合表達的載體構(gòu)建

將測序正確的Os08PTS啟動子的回收產(chǎn)物加尾后，與pCXGUSP質(zhì)粒片段（Xcm I酶切回收）克隆，重組啟動子載體名稱為PCXGUSOsP08PTS。用Bam HI單酶、Sca Ⅰ單酶、Hind Ⅲ單酶對重組啟動子載體進行酶切鑒定。挑選酶切條帶符合預期大小的正確單克隆，搖菌送福州尚亞生物技術有限公司完成測序。測序驗證后獲得正確的Os08PTS

啟動子載體電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以明恢86的幼胚，經(jīng)誘導后產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，水稻愈傷組織的誘導、繼代及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，抗性愈傷組織的篩選、分化及生根等相關的培養(yǎng)基和具體的試驗步驟參照本實驗室操作方法進行

[5]。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

采用CTAB法提取水稻幼嫩葉片的DNA[6]。以提取的DNA為模板，設計潮霉素標記基因的PCR引物，引物編號及序列為hyg1：TACACAGCCATCGGTCCAGA和

hyg2：TAGGAGGGCGTGGATATGTC，進行PCR擴增。PCR擴增程序：94℃ 3 min;94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃1 min，35個循環(huán);72℃，10 min。PCR產(chǎn)物大小為845 bp。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學染色

將轉(zhuǎn)基因水稻苗和野生型水稻苗的根、莖、葉、穎殼、花藥、種子各組織取下，置于2 mL離心管中，加入配制好的GUS染色液，37℃孵育24 h。取出材料，轉(zhuǎn)入75%酒精中脫色2～3次，以便徹底清除葉綠素。樣本保存于75%酒精中，肉眼或者顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Os08PTS啟動子的克隆和生物信息學分析

根據(jù)Os08PTS基因上游2000 bp的啟動子序列，通過PCR擴增得到1條長2000 bp的片段（圖1）。測序結(jié)果表明，該序列長度為2000 bp，與Genbank中預測的序列一致。進一步分析Os08PTS啟動子的順式作用元件，結(jié)果如表1所示，除了含有核心元件TATAbox和CAATbox外，該片段還含有與脫落酸相關元件ABRE，茉莉酸甲酯相關元件CGTCAmotif、TGACGmotif，赤霉素相關元件Pbox，光響應相關元件AEbox、Box4、Gbox、GATAmotif、Ibox、Lbox，參與防御和應激反應相關元件TCrich repeats，生長素反應元件TGAelement，與分生組織表達相關元件CATbox，胚乳表達相關元件GCN4_motif等。這些順式作用元件的存在，說明Os08PTS基因可能受光和多種激素的調(diào)控，還可能參與種子生長發(fā)育的調(diào)控。

2.2 啟動子載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將擴增得到一條長2000 bp的Os08PTS基因上游啟動子片段，加尾回收，通過TA克隆，連接到克隆載體PCXGUSP質(zhì)粒片段（Xcm I酶切回收）中。為了驗證目的片段是否成功連接至載體上，對重組載體進行單酶切檢測。根據(jù)PCXGUSP載體上的多克隆位點，同時結(jié)合Os08PTS啟動子序列上的酶切位點，選用Bam HI酶、Sca Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶分別對重組載體進行單酶切鑒定，出現(xiàn)條帶大小分別為2000、1609和1115 bp的目的條帶，結(jié)果如圖2所示，這充分表明Os08PTS基因啟動子已經(jīng)成功連接至PCXGUSP載體上。然后將酶切鑒定正確的重組載體送至尚亞公司測序，獲得含正確序列的目標片段的重組啟動子載體PCXGUSOsP08PTS（圖3）。采用電擊法將測序結(jié)果正確的重組啟動子載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織，獲得了轉(zhuǎn)化再生植株28個克隆。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

將分別提取的28個克隆水稻轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA作為模版，用PCR擴增潮霉素基因，PCR檢測結(jié)果如圖4所示。從部分轉(zhuǎn)基因植株中擴增出目的條帶，說明目的序列已經(jīng)整合到水稻基因組中。在28個克隆的水稻轉(zhuǎn)基因苗中，發(fā)現(xiàn)能擴增出目標片段大小的DNA條帶有27個克隆，而野生型水稻則不能擴增出目的基因大小的條帶，轉(zhuǎn)化陽性率為96.4%。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學染色

從27個陽性克隆水稻轉(zhuǎn)基因植株中隨機選取8個克隆進行GUS組織化學染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有檢測的陽性轉(zhuǎn)基因植株的胚均能被GUS染色液染成藍色，而根、葉、穎殼、花藥和胚乳等其他組織器官均檢測不到藍色，這與啟動子捕獲系突變體W8292的GUS表達特征類似，另外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的莖也能呈現(xiàn)出藍色，而啟動子捕獲系突變體W8292的莖沒有檢測到GUS活性（圖5），以上結(jié)果表明Os08PTS

上游2000 bp的啟動子區(qū)能驅(qū)動下游基因在胚表達中表達，同時還具有在莖中表達的特征。

3 結(jié)論與討論

磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白（PITP）是指負責內(nèi)膜系統(tǒng)間磷脂運輸?shù)牡鞍祝毡榇嬖谟诙嗉毎麆游?、真菌及高等植物中[7-9]。 研究表明，PITP在質(zhì)膜的運輸和信號轉(zhuǎn)導途徑中具有重要的作用，參與哺乳動物細胞分泌囊泡的形成、運輸、磷脂酶C調(diào)節(jié)的信號傳導，調(diào)節(jié)酵母胞質(zhì)內(nèi)膜組分運輸和脂類的代謝，以及參與高等植物發(fā)育過程的信號傳導[10-12]，但目前對其功能的分子機制仍不是很清楚。Os08PTS基因是一個在水稻胚中特異性表達PITP基因，本研究對其上游2000 bp的啟動子區(qū)的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)含有脫落酸、茉莉酸、赤霉素和生長素等相關的順式作用調(diào)控元件，表明Os08PTS基因在水稻胚中的表達可能受多種激素的調(diào)控，該結(jié)果為進一步研究Os08PTS基因在水稻胚中的調(diào)控作用提供了研究方向。

與組成型啟動子相比，組織特異型啟動子能減少外源基因表達產(chǎn)物的過度積累，不僅降低植物能量的浪費而且對轉(zhuǎn)基因植株正常生長的影響較小，因此在植物轉(zhuǎn)基因工程研究中具有廣泛的應用前景。本研究對

Os08PTS基因上游2000 bp的啟動區(qū)與GUS融合轉(zhuǎn)基因植株的表達分析發(fā)現(xiàn)該啟動子在莖和胚中特異表達，該結(jié)果與前期啟動子捕獲突變體W8292中GUS的胚特異性表達不太一致。前人研究也有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[13]，除了啟動子長度外，遠端的增強子、沉默子和絕緣子及基因本身的3′非翻譯區(qū)對基因表達特性均會產(chǎn)生影響[14]，具體原因需要進一步驗證。

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（責任編輯：柯文輝）