薄維波，李海英，安仲武，馮小娟，王 波，閆朝春△，朱洪波，郭加友

南京醫(yī)科大學(xué)康達學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院:1.檢驗科；2.普外科；3.腫瘤科，江蘇連云港 222042

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤前列[1]，早期HCC患者無明顯的癥狀，發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)已處于中晚期，病死率較高。因此，HCC的早期診斷、早治療，對患者的預(yù)后有很大幫助。LIEBMAN等[2]學(xué)者于1984年首次報道，約90%的HCC患者血清異常凝血酶原復(fù)合物即維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白(PIVKA-Ⅱ)水平明顯升高。細胞質(zhì)胸苷激酶1(TK1)是近年發(fā)現(xiàn)的新型腫瘤標志物，其血清水平的高低與腫瘤細胞增殖速度呈正比例關(guān)系，是影響HCC患者預(yù)后的一項獨立危險因素[3]。本研究旨在探討單獨及聯(lián)合檢測PIVKA-Ⅱ、TK1和甲胎蛋白(AFP)對HCC患者的診斷價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12月在本院診治的HCC患者61例、肝硬化(LC)患者50例、慢性肝炎(CH)患者58例及體檢健康者60例作為研究對象，分別作為HCC組、LC組、CH組及對照組。HCC組患者中男38例、女23例，年齡36～65歲、平均(52.4±7.1)歲，并按國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會(UICC/AJCC)2010年的TNM分期標準[4]分為Ⅰ～Ⅱ期53例、Ⅲ～Ⅳ期8例；LC組患者中男35例、女15例，年齡36～75歲、平均(57.3±7.5)歲；CH組患者中男38例、女20例，年齡31～75歲、平均(49.3±5.8)歲；對照組中男33例、女27例，年齡26～58歲、平均(42.4±5.8)歲。HCC、LC、HC的診斷分別符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》和《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標準[5-6]。4組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準后實施，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集與保存 抽取各研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-25 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2檢測方法 采用美國貝克曼公司Dxl 800 Access化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套的試劑盒檢測血清PIVKA-Ⅱ和AFP水平；采用深圳華瑞同康有限公司CIS-1型化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀及TK1細胞周期分析試劑盒檢測血清TK1水平。以上均嚴格按儀器及試劑盒說明書進行操作操作。正常參考范圍：PIVKA-Ⅱ<40 mAU/mL，TK1<2.0 pmol/L，AFP<10.0 ng/mL，高于正常參考值范圍為陽性。

2 結(jié) 果

2.1HCC組與良性肝病組患者一般資料比較 HCC組與良性肝病組患者(包括LC組、CH組患者)的年齡、性別、病原學(xué)資料、肝功能分級(Child-pugh分級)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。83.6%的HCC患者為乙型肝炎病毒(HBV)感染，62.3%的患者肝功能分級為Child-pugh B或C級。見表1。

表1 一般資料在HCC組與良性肝病組患者間的比較

2.2各組血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比較 經(jīng)K-S檢驗各組數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，故采用H檢驗進行組間比較，結(jié)果顯示，HCC組、LC組、CH組及對照組血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(H=65.30、55.47、38.69，P<0.05)。采用U檢驗進行兩兩比較，結(jié)果顯示，HCC組血清PIVKA-Ⅱ水平高于LC組、CH組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(u=1 368.47、544.62、1 687.21，P<0.05)；LC組、CH組血清PIVKA-Ⅱ水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(u=685.32、478.35，P>0.05)。HCC組血清TK1水平高于LC組、CH組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(u=221.56、248.63、542.11，P<0.05)；LC組、CH組血清TK1水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(u=1 683.41、659.23，P<0.05)；LC組和CH組血清TK1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(u=1 067.23，P>0.05)。HCC組血清AFP水平高于LC組、CH組及對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(u=425.36、1 652.31、488.25，P<0.05)；LC組、CH組血清AFP水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(u=1 425.47、887.36，P<0.05)；LC組和CH組血清AFP水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(u=1 678.36，P>0.05)。在HCC組中，血清PIVKA-Ⅱ、TK1水平隨著病理分期嚴重程度的增加而逐漸升高，Ⅰ～Ⅳ期血清PIVKA-Ⅱ、TK1水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(H=24.38、31.21，P<0.05)。見表2。

表2 各組血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比較[M(P25,P75)]

2.3PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP單項及聯(lián)合檢測對HCC的診斷效能 單獨檢測診斷HCC時，PIVKA-Ⅱ的靈敏度(86.89%)和TK1的特異度(86.62%)最高；2項聯(lián)合檢測診斷HCC時，AFP/TK1并聯(lián)檢測(其中一項陽性即為陽性)的靈敏度(91.80%)和AFP+PIVKA-Ⅱ串聯(lián)檢測(2項均陽性才為陽性)的特異度(95.88%)最高；3項聯(lián)合檢測診斷HCC時，AFP/TK1/PIVKA-Ⅱ并聯(lián)檢測(其中一項陽性即為陽性)的靈敏度(95.08%)和AFP+TK1+PIVKA-Ⅱ串聯(lián)檢測(3項均陽性才為陽性)的特異度(96.29%)較高。PIVKA-Ⅱ、TK1、AFP單獨檢測診斷HCC的最佳臨界值分別為35.88 mAU/mL、2.15 pmol/L和11.70 ng/mL，3項聯(lián)合檢測診斷HCC的AUC[0.928(95%CI：0.799～0.952)]高于單獨檢測診斷HCC的AUC[0.839(95%CI：0.753～0.886)、0.801(95%CI：0.720～0.843)、0.708(95%CI：0.549～0.740)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3～5、圖1。

表3 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP單獨及聯(lián)合檢測對HCC的診斷效能

表4 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP聯(lián)合檢測診斷HCC的Logistic回歸分析擬合參數(shù)

表5 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP單項檢測及三項聯(lián)合檢測診斷HCC的AUC及相關(guān)參數(shù)

注：A、B、C、D分別為AFP、TK1、PIVKA-Ⅱ單獨檢測及三項聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線。

2.4PIVKA-Ⅱ、TK1在AFP陰性的HCC患者中的檢測意義 在26例AFP陰性的HCC患者中，PIVKA-Ⅱ陽性21例，靈敏度為80.77%；TK1陽性15例，靈敏度為57.69%；PIVKA-Ⅱ和TK1聯(lián)合檢測陽性24例，靈敏度為92.31%。PIVKA-Ⅱ和TK1聯(lián)合檢測的靈敏度高于單獨檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤，其病死率在惡性腫瘤中居于第2位，早期診斷HCC是治療和延長患者生存期的關(guān)鍵。迄今為止，AFP是臨床上使用最廣泛的HCC血清學(xué)標志物，但是其診斷的靈敏度及特異度均較低，約有30%的HCC患者AFP呈陰性[7]，存在一定的漏診率，而與其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測可能會增加HCC的確診率[8]。

PIVKA-Ⅱ被認為是一種新型的腫瘤標志物，在日本和歐美一些發(fā)達國家，有研究表明PIVKA-Ⅱ?qū)τ贖CC的診斷效能明顯高于AFP，其作為HCC常規(guī)篩查手段在臨床已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[9]，現(xiàn)已將PIVKA-Ⅱ作為診斷HCC的一項重要指標。

TK1于19世紀60年代被發(fā)現(xiàn)在增殖細胞中表達[9]。癌癥患者血清中TK1水平和活性升高，而健康人較低或檢測不出。有研究表明，TK1可以適用于惡性腫瘤的細胞增殖度檢測，對腫瘤細胞增殖活性的檢測、療效監(jiān)測和預(yù)后評估具有重要的臨床意義[10-11]。

我國作為肝癌大國，每年肝癌的發(fā)病率約占全世界的一半以上，其中90%的病因為HBV感染，與日本和歐美的以HCV感染和酒精性肝病為主要病因?qū)W組成有明顯區(qū)別。本研究顯示，PIVKA-Ⅱ水平在HCC患者血清中升高，HCC組與LC組、CH組、對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證實血清PIVKA-Ⅱ是診斷HCC的一個較好指標。當發(fā)生HCC時，患者體內(nèi)癌細胞合成凝血酶原前體發(fā)生異常，凝血酶原前體羧化缺乏，導(dǎo)致PIVKA-Ⅱ的生成量增加，使血清中PIVKA-Ⅱ水平明顯升高。此外，本研究還顯示，LC組和CH組的血清PIVKA-Ⅱ水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而LC組和CH組的血清TK1和AFP水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明PIVKA-Ⅱ不易受CH、LC等非HCC因素的影響，而AFP和TK1診斷HCC容易受到非HCC因素的影響，提示PIVKA-Ⅱ比TK1能更好地區(qū)分良惡性肝病，可作為HCC早期篩查的重要腫瘤標志物，此研究結(jié)果與LIM等[12]、羅麗丹等[13]的研究報道一致。

血清腫瘤標志物單項檢測診斷HCC的靈敏度和(或)特異度欠佳，為減少漏診、誤診，可采用血清腫瘤標志物多項聯(lián)合檢測診斷HCC。單項指標檢測診斷HCC時，PIVKA-Ⅱ的靈敏度(86.89%)最高，但TK1的特異度(86.62%)最高；兩項檢測方案中，AFP/TK1并聯(lián)檢測的靈敏度(91.80%)最高，而AFP+PIVKA-Ⅱ串聯(lián)檢測的特異度(95.88%)最高；3項檢測方案中，AFP/TK1/PIVKA-Ⅱ并聯(lián)檢測的靈敏度(95.08%)較高，而AFP+TK1+PIVKA-Ⅱ串聯(lián)檢測的特異度(96.29%)更高。PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP聯(lián)合檢測診斷HCC的AUC為0.928，高于各指標單獨檢測(P<0.05)，且靈敏度和特異度也較各指標單獨檢測高，進一步驗證了聯(lián)合檢測可明顯提高HCC的診斷效能，對HCC高危人群的篩查及早期診斷有重要的臨床參考價值。另外，通過ROC曲線得出PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP診斷HCC的最佳臨界值分別為35.88 mAU/mL、2.15 pmol/L和11.70 ng/mL；其中PIVKA-Ⅱ的最佳臨界值比文獻[14-15]報道的40 mAU/mL略低，其原因可能為納入的HCC患者主要為術(shù)前或行介入治療的早中期患者(Ⅰ～Ⅱ期53例，占86.89%)，晚期患者納入不足(Ⅲ～Ⅳ期8例，僅占13.11%)，導(dǎo)致HCC組PIVKA-Ⅱ平均水平有所降低，使最佳臨界值略低于文獻報道。另外，值得一提的是，本研究26例AFP陰性的HCC患者中有21例PIVKA-Ⅱ陽性，靈敏度達到80.77%，與林鶯鶯等[16]報道觀點相近，PIVKA-Ⅱ在AFP陰性的HCC患者中有較高的靈敏度，提示血清PIVKA-Ⅱ在診斷AFP陰性的HCC時也存在一定的優(yōu)勢。此外，PIVKA-Ⅱ和TK1串聯(lián)檢測可提升特異度，說明PIVKA-Ⅱ和TK1串聯(lián)檢測能有效地避免部分AFP陰性HCC病例的漏檢，該研究結(jié)論亦少見相關(guān)文獻報道。

綜上所述，PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP聯(lián)合檢測可提高診斷HCC的靈敏度，PIVKA-Ⅱ和TK1檢測對AFP陰性的HCC患者具有互補性，對HCC的早期診斷具有重要的應(yīng)用價值。本研究作為回顧性研究，樣本量較小，納入的病例代表性有限，可能存在選擇偏倚、信息偏倚等局限性，仍需進行大樣本量的前瞻性、多中心研究進一步證實本研究所得結(jié)論。