陶天宇 程雪飛

（1，安徽省宣城市郎溪縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物疫控中心 241000；2，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 200000）

高致病性禽流感（HPAI）致病原是正黏病毒科A 型流感病毒，該病毒主要傳播途徑為呼吸道，通常由禽類的分泌物、排泄物，受病毒污染的水等作為媒介傳播。發(fā)病高峰期為春冬交替季節(jié)。現(xiàn)已衍生出16 種H 亞型和9 種N 亞型，其中毒力最強(qiáng)、致死率較高的亞型有H5N1、H7N9。禽類感染后主要病理變化為外部冠及肉髯發(fā)紺水腫，頭部及臉瞼水腫，病禽病例解剖后內(nèi)臟漿膜、呼吸道和消化道黏膜、心臟發(fā)生大面積點(diǎn)狀或斑狀出血，腎、肝、肺表面和切面可見大小不均的灰黃色壞死灶等。急性禽流感感染的一般成爆發(fā)性流行態(tài)勢(shì)，可出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)雞群大量死亡，解剖時(shí)無明顯病變，致死率可達(dá)90%以上[1]。

雞新城疫（ND）是由副黏病科毒I 型病毒引起的禽類動(dòng)物疫病，主要傳播途徑為呼吸道和消化道。該病全年易發(fā)，尤春秋高發(fā)期。目前該病毒未發(fā)現(xiàn)其他血清型。禽類感染后主要病理變化為呼吸困難[2]，張口伸頸發(fā)出咯咯喘鳴，冠和髯呈暗紅色和暗紫色，全身漿膜及呼吸道出血，淋巴結(jié)腫脹出血或壞死，腺胃黏膜和黏膜乳頭水腫出血，盲腸扁桃體及回腸黏膜出血或壞死等。急性新城疫死亡率可達(dá)90%～100%。

高致病禽流感（HPAI）和雞新城疫（ND）均為烈性動(dòng)物傳染病，具有高傳染性、高致病性和高致死率，是嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的一類動(dòng)物疫病。我國(guó)防控高致病禽流感和新城疫的舉措主要為肌肉注射接種疫苗，因此，疫苗的免疫程序是影響免疫效果的重要因素之一。為監(jiān)測(cè)疫苗免疫效果，采集郎溪縣3 個(gè)大型817 肉雞場(chǎng)共計(jì)420 個(gè)樣本，采用凝血抑制（HI）法評(píng)估免疫效果，為本縣內(nèi)各養(yǎng)殖場(chǎng)針對(duì)新城疫和高致病禽流感的防控工作提供方案與數(shù)據(jù)參考[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通離心機(jī)，微型振蕩儀，0.1～1ml 移液器若干，2～10ml移液器若干，移液器槍頭若干，96 孔V 型血凝反應(yīng)板5 塊，50ml 燒杯若干，500ml 燒杯2 個(gè)，5ml 醫(yī)用注射器若干，10ml醫(yī)用注射器若干，生理鹽水750ml，3.8%檸檬酸鈉溶液30ml，新城疫和禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清2 份[4]。

1.2 血清樣本采集

本次試驗(yàn)所用的817 肉雞血清均來自郎溪縣境內(nèi)的3 家大型肉雞場(chǎng)。新城疫與禽流感免疫程序：9 日齡肌肉注射新城疫—禽流感H5N1二聯(lián)滅活疫苗，0.2ml/只；17 日齡肌肉注射禽流感H7N9滅活疫苗，0.5ml/只；40 日齡新城疫—禽流感H5N1二聯(lián)滅活疫苗，0.5ml/只；58 日齡肌肉注射禽流感H7N9滅活疫苗，0.5ml/只[5]。

采血時(shí)間為75 日齡肉雞，樣本數(shù)量為每個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)120 份，共計(jì)420 份。翅下靜脈采血，每只雞采血2ml，標(biāo)記密封后靜置30min，低速離心機(jī)4500rpm 分離血清，-18℃冰箱冷藏。

1.3 試劑準(zhǔn)備

新城疫、禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清均采購于洛陽萊普森生物信息科技有限公司。

阿氏（ALsever）液配制：稱量葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.42g，混合后加蒸餾水至100ml，散熱溶解后將pH 調(diào)至6.1，69kPa 15min 高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1%紅細(xì)胞懸液配制（100ml）：準(zhǔn)備2 只SPF 雞采血2～4ml與阿氏液1ml 混合后，放入裝10ml 阿氏液的離心管中混勻，經(jīng)1500～1800rpm 離心8min，吸出上清液舍棄，沉淀物加阿氏液混合后，再經(jīng)1500～1800rpm 離心8min，吸出上清液及沉淀的紅細(xì)胞上層白細(xì)胞膜舍棄，重復(fù)2 次以上過程后，加入阿氏液20ml，輕輕混合制成紅細(xì)胞懸液。取制備好的紅細(xì)胞懸液1ml，加入99ml PBS 溶液輕輕混合或用吸管反復(fù)吸打即可[6]。

1.4 檢測(cè)方法

本次新城疫和禽流感抗體檢測(cè)均采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）方法。新城疫檢測(cè)采用GB/T 16550-2008 《新城疫診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)操作，禽流感檢測(cè)采用GB/T 18936-2003 《高致病性禽流感診斷技術(shù)》 標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.5 結(jié)果判定

以完全抑制4 個(gè)HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)為HI 的抗體滴度。新城疫HI 抗體滴度≥5Log2 判定為合格，禽流感HI抗體滴度≥5Log2 判定為合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 新城疫抗體效價(jià)分析

由表1 可知，A 場(chǎng)肉雞新城疫抗體合格率為95.8%，平均抗體滴度為8.4；B 場(chǎng)新城疫抗體合格率為91.6%，平均抗體滴度為8.3；C 場(chǎng)新城疫抗體合格率為91.6%，平均抗體滴度為8.6。A、B、C 三場(chǎng)75 日齡肉雞HI 抗體效價(jià)均大于70%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度7.8～8.9。說明該新城疫免疫程序正確有效，抗體效價(jià)和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護(hù)能力。

表1 75 日齡肉雞新城疫抗體效價(jià)結(jié)果

2.2 禽流感H5N1-Re5 抗體效價(jià)分析

由表2 可知，A 場(chǎng)肉雞禽流感H5N1-Re5 抗體合格率為97.5%，平均抗體滴度為8.7；B 場(chǎng)抗體合格率為92.5%，平均抗體滴度為8.2；C 場(chǎng)抗體合格率為90.8%，平均抗體滴度為8.8。A、B、C 三場(chǎng)75 日齡肉雞HI 抗體效價(jià)均大于80%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。說明該禽流感H5N1-Re5 免疫程序正確有效，抗體效價(jià)和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護(hù)能力。

表2 75 日齡肉雞禽流感H5N1-Re5 抗體效價(jià)結(jié)果

2.3 禽流感H7N9 抗體效價(jià)分析

由表3 可知，A 場(chǎng)肉雞禽流感H7N9抗體合格率為94.2%，平均抗體滴度為8.7；B 場(chǎng)抗體合格率為96.7%，平均抗體滴度為8.1；C 場(chǎng)抗體合格率為90.0%，平均抗體滴度為8.0。A、B、C 三場(chǎng)75 日齡肉雞HI 抗體效價(jià)均大于90%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。說明該禽流感H7N9免疫程序正確有效，抗體效價(jià)和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護(hù)能力。

表3 75 日齡肉雞禽流感H7N9 抗體效價(jià)結(jié)果

3 討論

（1）本試驗(yàn)采取的免疫程序適用于養(yǎng)殖量較大，雞舍較為密集的大型肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，理論上新城疫和禽流感抗體陽性率不小于70%即可說明免疫程序合理，對(duì)雞場(chǎng)可形成有效的保護(hù)力。但免疫效果易受雞群免疫應(yīng)答能力、疫苗品牌、接種方式、雞舍衛(wèi)生狀況及當(dāng)?shù)亓餍胁B(tài)勢(shì)等因素影響。為保障雞群生物安全，大型的養(yǎng)殖企業(yè)（場(chǎng)）有必要定期對(duì)階段性免疫進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)抽查，及時(shí)控制疫病發(fā)生，防患于未然[7]。

（2）本試驗(yàn)新城疫和高致病性禽流感滅活疫苗交替免疫。全程新城疫、禽流感H5N1免疫間隔為31d，禽流感H7N9免疫間隔為41d。高致病型H5N1、H7N9是我國(guó)禽流感流行的主型，并且仍有發(fā)展出新基因型的趨勢(shì)。將該型滅活疫苗一免和二免間隔適當(dāng)加長(zhǎng)3～7d 有助于雞群體液免疫引起良好的二次免疫應(yīng)答，從而形成有效的保護(hù)力。