呂天寶，王佳琪，謝旭峰，宋 寧，關(guān)鈺穎，吳殿君，張文龍，曹永國(guó)

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130062)

鉤端螺旋體病是一種由致病性鉤端螺旋體(鉤體)引起的，除南極洲以外世界范圍內(nèi)廣泛存在的人獸共患病[1]。鉤體是一種專性需氧的革蘭陰性細(xì)菌，可分為非致病性和致病性兩大類，呈螺旋形，長(zhǎng)6～20 μm，直徑約0.1 μm[1]。鉤體通過(guò)擦傷、割傷或直接穿過(guò)正常的皮膚和黏膜進(jìn)入人體，然后進(jìn)入血管并通過(guò)血流到達(dá)全身組織器官，最終定居在腎臟，鉤體經(jīng)患病動(dòng)物或人的尿液排出，污染水源和土壤，人和動(dòng)物可因直接或間接接觸被污染的水和土壤而感染[2]。不同的動(dòng)物感染不同血清型鉤體表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，從輕度的流感樣疾病到嚴(yán)重的感染，包括腎和肝衰竭，肺部疾病和死亡。典型癥狀為黃疸，典型病理變化為肺出血[1]。迄今為止，有關(guān)鉤體入胞機(jī)制尚未被闡明。

脂筏是質(zhì)膜中功能性的納米級(jí)膜結(jié)構(gòu)域，富含膽固醇和鞘脂，其中包含多種信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3]。越來(lái)越多的病原體(包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等)如大腸埃希菌、假單胞菌、衣原體和A型流感病毒等，已被證明其侵入宿主細(xì)胞需要脂筏[4-7]。例如，SEVEAU等[8]發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白和InlB-HGF-R/Met介導(dǎo)的單核細(xì)胞增生性李斯特菌進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏結(jié)構(gòu)的完整性。但是，鉤體進(jìn)入細(xì)胞是否與脂筏相關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和細(xì)胞致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴型賴株(56601)、鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(J774A.1，ATCC編號(hào)TIB-67)和非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(Vero細(xì)胞，ATCC編號(hào)CCL-81)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與試劑CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱購(gòu)自日本三洋公司；暗視野顯微鏡購(gòu)自德國(guó)奧林巴斯公司；Petroff-Hauser細(xì)菌計(jì)數(shù)板購(gòu)自美國(guó)托馬斯公司；共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)奧林巴斯公司；通用型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；LC3B、LAMP-1和Caveolin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；β-actin以及各種二抗購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司；MβCD和膽固醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；3MA和雷帕霉素購(gòu)自中國(guó)瀚香生物科技有限公司；Lipofectamine RNAiMAX試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Cav-1 siRNA購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 細(xì)胞與細(xì)菌培養(yǎng)致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴型賴株(56601)在29℃的Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris(EMJH)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)感染金黃地鼠保持毒力。對(duì)于所有細(xì)胞試驗(yàn)，鉤體在液體EMJH培養(yǎng)基中的傳代次數(shù)少于3次。J774A.1和Vero細(xì)胞分別培養(yǎng)在含有10%和2%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)將J774A.1細(xì)胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的MβCD作用30 min后，用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性。

1.5 細(xì)胞處理與感染將J774A.1細(xì)胞和Vero細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，在完全培養(yǎng)基中預(yù)孵育12 h。將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、MβCD組和MβCD+膽固醇組，然后將MβCD組在含有(10 mmol/L)MβCD的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37℃孵育30 min，MβCD+膽固醇組在含有10 mmol/L MβCD的RPMI 1640培養(yǎng)基中處理30 min 后再在含200 mg/L膽固醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃孵育30 min。用PBS洗滌后，3組細(xì)胞以1∶100的劑量感染致病性菌株56601。將細(xì)胞在5% CO2中于37℃孵育40 min，用PBS洗滌，經(jīng)胰蛋白酶消化的離心(1 200 r/min)收集細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取DNA以測(cè)量胞內(nèi)鉤體量。

將J774A.1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，12 h后以1∶100的比例感染鉤體，同時(shí)加入3MA(10 mmol/L)或雷帕霉素(50 mg/L)，2 h后收集細(xì)胞，用1 mL蒸餾水裂解細(xì)胞，吸取100 μL裂解液加入到3 mL EMJH培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4～6 d，在暗視野顯微鏡下用Petroff-Hauser細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.6 小窩蛋白(Cav-1)的小RNA干擾試驗(yàn)使用Lipofectamine RNAiMAX試劑將siRNA轉(zhuǎn)染到J774A.1細(xì)胞中，并在24 h后對(duì)Cav-1進(jìn)行免疫熒光染色，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鉤體感染試驗(yàn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)致病性鉤體特異性基因LipL32設(shè)計(jì)引物[9]，對(duì)胞內(nèi)鉤體進(jìn)行熒光定量PCR分析(絕對(duì)定量)，使用體外培養(yǎng)細(xì)菌中提取的DNA的梯度稀釋液(109～102)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定鉤體量。

1.8 激光共聚焦顯微鏡將多聚賴氨酸處理過(guò)的12 mm細(xì)胞爬片置于24孔板中，以2×105個(gè)/孔的數(shù)量接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和MβCD組，分別處理后，以1∶100的比例感染鉤體，感染40 min后，吸去上清，用預(yù)冷的PBS清理3次，加4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次后，以含2% BSA的PBS溶液室溫封閉30 min，用抗鉤體一抗室溫孵育30 min，PBS清洗3次后，用FITC標(biāo)記的熒光二抗室溫孵育30 min，對(duì)細(xì)胞外的鉤體進(jìn)行熒光染色。PBS清洗3次后，用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室溫處理10 min，PBS清洗1次后再用含2% BSA的PBS溶液室溫封閉30 min，用抗鉤體一抗室溫孵育30 min，PBS清洗3次后，用TRITC熒光二抗室溫孵育30 min，對(duì)胞內(nèi)鉤體進(jìn)行熒光染色。用PBS清洗3次后，用Hoechst染色5 min，清洗3次后將細(xì)胞爬片以甘油黏附到載玻片上，置于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot將J774A.1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，并在完全培養(yǎng)基中預(yù)孵育12 h。將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、MβCD組、鉤體組和MβCD+鉤體組。用MβCD刺激30 min后感染細(xì)胞，于感染后4 h收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3遍，用蛋白提取試劑裂解細(xì)胞10 min，然后用超速離心機(jī)以4℃ 12 000 r/min離心10 min收集上清液，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100℃加熱8 min使蛋白變性，配置15% SDS-PAGE濃縮膠以及分離膠，以30 μg/孔蛋白量上樣，80 V電泳20 min后轉(zhuǎn)用120 V 電泳1 h，然后通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用相應(yīng)的一抗在4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，用TBST溶液清洗3次后，常溫下用二抗孵育2 h，用TBST溶液清洗3次后即可在顯影儀下檢測(cè)蛋白量。

2 結(jié)果

2.1 鉤體進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏介導(dǎo)免疫熒光和Western blot結(jié)果表明，MβCD和Cav-1 siRNA都能破壞細(xì)胞的脂筏結(jié)構(gòu)(圖1)，并且，細(xì)胞毒性試驗(yàn)分析表明MβCD對(duì)細(xì)胞沒(méi)有潛在的毒性(圖2)。因此，MβCD和Cav-1 siRNA能夠用做脂筏破壞的試劑進(jìn)行接下來(lái)的試驗(yàn)。

A.MβCD(10 mmol/L)刺激細(xì)胞30 min以及Cav-1 siRNA(100 nmol/L)刺激細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞小窩蛋白的熒光染色,其中每個(gè)樣品至少隨機(jī)拍攝10張不同部位的圖片，圖中展示了各組代表性結(jié)果(×400)；B.Western blot檢測(cè)Cav-1 siRNA的沉默效果，試驗(yàn)重復(fù)3次

以不同濃度MβCD處理J774A.1細(xì)胞30 min，然后用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性。ns表示P>0.05，無(wú)顯著性差異

用qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鉤體量，結(jié)果表明，用MβCD破壞脂筏后，進(jìn)入J774A.1細(xì)胞內(nèi)的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補(bǔ)脂筏后，胞內(nèi)鉤體量有所升高(圖3A),證明鉤體進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏。為了驗(yàn)證這個(gè)現(xiàn)象，采用了小RNA干擾技術(shù)，敲低了細(xì)胞的小窩蛋白，結(jié)果表明，敲低細(xì)胞的小窩蛋白后，進(jìn)入J774A.1細(xì)胞的鉤體量明顯降低(圖3C)。在Vero細(xì)胞的試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，即用MβCD破壞脂筏后，細(xì)胞內(nèi)的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補(bǔ)脂筏后，胞內(nèi)鉤體量有所升高(圖3B)。激光共聚焦結(jié)果直觀地表明，脂筏被破壞后，胞內(nèi)的鉤體量明顯減少(圖3D)。

A,B.J774A.1和Vero細(xì)胞在正常狀態(tài)，MβCD破壞脂筏的狀態(tài)以及膽固醇回補(bǔ)狀態(tài)下，鉤體進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量的檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次；C.J774A.1細(xì)胞在正常狀態(tài)以及Cav-1 siRNA破壞脂筏的狀態(tài)下，進(jìn)入細(xì)胞的鉤體數(shù)量檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次；D.激光共聚焦顯微鏡下觀察胞內(nèi)外鉤體的熒光染色結(jié)果(×1 000)。*表示P<0.05，顯示有顯著性差異；**表示P<0.01，顯示有非常極顯著性差異；***表示P<0.001，顯示有極顯著性差異。下同

2.2 脂筏影響胞內(nèi)鉤體的存活透射電子顯微鏡下觀察在有無(wú)脂筏的情況下鉤體進(jìn)入細(xì)胞的情況，結(jié)果顯示在感染后40 min，破壞脂筏結(jié)構(gòu)的J774A.1細(xì)胞(圖4E)比正常細(xì)胞(圖4B)中的鉤體量明顯較少。在感染后4 h，正常細(xì)胞中還有大量鉤體，其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變(圖4C)，但是在脂筏被破壞的細(xì)胞中，感染后4 h的胞內(nèi)鉤體基本被殺死，并且形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)模糊(圖4F)。另外，通過(guò)qPCR檢測(cè)了感染后4 h的胞內(nèi)鉤體量，結(jié)果表明，與正常組相比，脂筏被破壞后，細(xì)胞殺滅鉤體的能力增強(qiáng)(圖4G)。此外，液體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)試驗(yàn)也證明了脂筏被破壞后，細(xì)胞殺滅鉤體的能力增強(qiáng)(圖4H)。

A.透射電子顯微鏡下，正常狀態(tài)下J774A.1細(xì)胞圖；B.正常J774A.1細(xì)胞感染后40 min胞內(nèi)鉤體的情況；C.正常J774A.1細(xì)胞感染后4 h胞內(nèi)鉤體的情況；D.脂筏破壞后的J774A.1細(xì)胞圖；E.脂筏破壞后，J774A.1細(xì)胞感染后40 min胞內(nèi)鉤體的情況；F.脂筏破壞后，J774A.1細(xì)胞感染后4 h胞內(nèi)鉤體的情況；G.qPCR檢測(cè)感染后40 min以及4 h J774A.1細(xì)胞在有無(wú)脂筏狀態(tài)下胞內(nèi)的鉤體量，試驗(yàn)重復(fù)3次；H.液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果表示感染后40 min以及4 h J774A.1細(xì)胞在有無(wú)脂筏狀態(tài)下胞內(nèi)存活的鉤體量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 破壞脂筏增強(qiáng)了鉤體感染引起的細(xì)胞自噬水平Western blot結(jié)果表明，用MβCD破壞脂筏后，J774A.1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的水平明顯增高，溶酶體標(biāo)記性蛋白LAMP-1的水平也明顯增高(圖5A)。并且，在感染鉤體后，與對(duì)照組相比，脂筏破壞組的LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的水平明顯較高。證明脂筏被破壞，感染鉤體后，細(xì)胞的自噬水平明顯增強(qiáng)(圖5A)。另一方面，用自噬的抑制劑(3MA)和激活劑(雷帕霉素)分別刺激感染鉤體的J774A.1細(xì)胞，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定胞內(nèi)鉤體量，結(jié)果表明，用雷帕霉素激活細(xì)胞自噬后，胞內(nèi)存活的鉤體明顯較少(圖5B)。由以上結(jié)果可知，破壞脂筏可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平，自噬水平的增強(qiáng)有助于細(xì)胞殺滅胞內(nèi)的鉤體。

A.脂筏完整和被破壞狀態(tài)下感染鉤體后4 h的自噬標(biāo)記分子蛋白免疫印跡圖以及LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，試驗(yàn)重復(fù)3次；B.3MA和雷帕霉素分別刺激細(xì)胞后，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)測(cè)得細(xì)胞內(nèi)存活的鉤體量

3 討論

鉤體為非專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)而不損壞細(xì)胞的功能。鉤體通過(guò)人或動(dòng)物破損的皮膚或黏膜進(jìn)入體內(nèi)，隨血流遍布全身組織器官。敏感動(dòng)物感染后急性死亡，耐受動(dòng)物發(fā)展成慢性腎臟疾病，其腎臟中有大量鉤體定殖，并隨尿液排出，污染土壤和水源，嚴(yán)重威脅著社會(huì)公共衛(wèi)生安全[10]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1125號(hào)公告也將鉤體病列為我國(guó)二類動(dòng)物疫病，第1149號(hào)公告將其列入人獸共患傳染病名錄。但是，鉤體進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制以及其在胞內(nèi)移行及胞間的穿行機(jī)制還未被闡明。

脂筏是脂膜上富含鞘磷脂和膽固醇的微結(jié)構(gòu)域，其包含多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如小窩蛋白[11-12]。越來(lái)越多的病原體，例如大腸埃希菌、假單胞菌、衣原體和A型流感病毒等，已被證明其侵入宿主細(xì)胞需要脂筏[4-7]。因此，需要探究脂筏是否在鉤體入胞過(guò)程中發(fā)揮作用。

試驗(yàn)證明MβCD對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，并且免疫熒光結(jié)果表明，J774A.1細(xì)胞在MβCD作用30 min后，脂筏的標(biāo)志性蛋白小窩蛋白1(Caveolin-1)的表達(dá)明顯降低，因此，參照之前的研究[13-14]，采用MβCD破壞細(xì)胞的脂筏結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比，在對(duì)J774A.1細(xì)胞進(jìn)行脂筏結(jié)構(gòu)的破壞后，進(jìn)入細(xì)胞的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補(bǔ)脂筏結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的鉤體量有所升高，證明鉤體進(jìn)入J774A.1細(xì)胞需要脂筏。為了避免單一藥物的偶然性，用小RNA干擾技術(shù)敲低細(xì)胞Cav-1的表達(dá)[15]，結(jié)果表明，Cav-1的表達(dá)降低后，進(jìn)入細(xì)胞的鉤體量同樣減少，再次驗(yàn)證了鉤體進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏。為了驗(yàn)證這個(gè)現(xiàn)象是否與細(xì)胞類型有關(guān)，用Vero細(xì)胞重復(fù)了同樣的試驗(yàn)，結(jié)果也表明鉤體進(jìn)入細(xì)胞對(duì)脂筏的依賴性。另外，激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果更直觀地顯示這一現(xiàn)象。這些結(jié)果共同表明鉤體進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏，當(dāng)脂筏結(jié)構(gòu)的完整性被破壞后，鉤體進(jìn)入細(xì)胞的能力明顯降低，并且，這個(gè)現(xiàn)象與巨噬細(xì)胞的主動(dòng)吞噬作用無(wú)關(guān)。這種對(duì)脂筏的依賴性在單核細(xì)胞增生性李斯特桿菌和豬流行性腹瀉病毒的入胞過(guò)程中同樣被證實(shí)[8,16]。

接下來(lái)，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察J774A.1細(xì)胞在有無(wú)脂筏結(jié)構(gòu)的情況下感染后40 min及感染4 h后胞內(nèi)鉤體的數(shù)量和形態(tài)。結(jié)果表明，在感染后40 min，破壞脂筏結(jié)構(gòu)的J774A.1細(xì)胞內(nèi)的鉤體量明顯減少；在感染后4 h，對(duì)照組胞內(nèi)仍有大量鉤體，并且其形態(tài)完整，而脂筏破壞組胞內(nèi)的鉤體基本消失，形態(tài)模糊。從胞內(nèi)鉤體全菌熒光定量和活菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果可知，在感染后4 h，脂筏破壞組胞內(nèi)的鉤體幾乎全被清除。這些結(jié)果表明破壞脂筏后，細(xì)胞殺滅鉤體的能力增強(qiáng)。

有研究表明，脂筏AKT-FOXO1途徑會(huì)影響自噬的調(diào)節(jié)，脂筏的破壞會(huì)誘導(dǎo)自噬[17]。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)成分的過(guò)程，同時(shí)也具有重要的宿主防御功能。因此，探究中破壞脂筏后，細(xì)胞殺滅鉤體的能力增強(qiáng)是否與細(xì)胞自噬增強(qiáng)有關(guān)，結(jié)果表明，破壞脂筏能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白表達(dá)，證明破壞脂筏能夠增強(qiáng)自噬水平以及鉤體感染后的自噬水平。因此，細(xì)胞自噬水平的升高可能有助于殺滅胞內(nèi)的鉤體。為驗(yàn)證這一猜想，分別用自噬激活劑(雷帕霉素)和自噬抑制劑(3MA)處理鉤體感染的J774A.1細(xì)胞，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果表明，雷帕霉素能夠顯著降低胞內(nèi)鉤體量，證明自噬水平的增強(qiáng)有助于殺滅胞內(nèi)鉤體。以上結(jié)果表明，破壞細(xì)胞脂筏增強(qiáng)了細(xì)胞自噬和細(xì)胞殺滅鉤體的能力。

綜上所述，本研究證明鉤體進(jìn)入細(xì)胞需要脂筏，在破壞脂筏后，鉤體進(jìn)入細(xì)胞的量明顯降低，并且細(xì)胞殺滅鉤體的能力增強(qiáng)，可能的原因是因?yàn)槠茐闹ぜ訌?qiáng)了細(xì)胞的自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)鉤體進(jìn)入細(xì)胞與脂筏結(jié)構(gòu)的完整性相關(guān)，為鉤體病預(yù)防產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。