任艷華,李 慧， 張雋美， 張玉茹＊

（1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng)453007）

近年來(lái)，隨著生產(chǎn)力的發(fā)展，重金屬加重了對(duì)河流、湖泊等水體的污染程度，成為水生生態(tài)環(huán)境的持久性污染物。其中，鎘作為一種有毒的重金屬，通常以離子的形式存在于環(huán)境中，由于其半衰期長(zhǎng)，不易被降解，會(huì)隨著廢水等進(jìn)入湖泊河流等水環(huán)境并進(jìn)入生物鏈，并在人及動(dòng)物體內(nèi)蓄積，對(duì)人及動(dòng)物的健康帶來(lái)極大的危害。已有研究表明，長(zhǎng)期暴露在鎘等重金屬污染水體中的魚(yú)類，呈現(xiàn)代謝紊亂、免疫功能紊亂、肝臟和腎等器官病變等癥狀[1,2]。2012年，研究者對(duì)東北三省3種魚(yú)的肌肉樣品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，鎘在鯉魚(yú)、草魚(yú)、鯽魚(yú)中超標(biāo)，超標(biāo)率高達(dá)1.1%，其中鯉魚(yú)肌肉中鎘平均含量為0.01 mg/kg[3]，其含量接近珠江三角洲鯉魚(yú)中鎘的平均含量（0.01 mg/kg）[4]，低于太湖中鯉魚(yú)肌肉鎘的平均含量（0.014 mg/kg）[5]?？梢?jiàn)，魚(yú)體內(nèi)鎘含量存在超標(biāo)現(xiàn)象，鎘對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)、代謝和免疫功能等的影響已引起人們的重視。但是，目前的研究多集于鎘對(duì)水生動(dòng)物免疫毒性的研究，較少的從魚(yú)類脂代謝的角度進(jìn)行研究，亟需深入研究。

2018年，全球魚(yú)類產(chǎn)量大約為1.79億噸，8210萬(wàn)噸來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖，其中鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的養(yǎng)殖量達(dá)到了418.95萬(wàn)噸[6]。鯉因其體態(tài)豐滿，肉質(zhì)肥厚，細(xì)嫩鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富而成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，由于它們對(duì)污染的水環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，而被用作了解環(huán)境污染的生物指標(biāo)物種[7,8]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬水體中鎘的濃度，進(jìn)行為期30 d的Cd2+暴露實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)鎘對(duì)鯉肝體比、臟體比、肝臟脂肪蓄積、肝臟和肌肉脂肪酸成分和含量的影響，以期為防治水體鎘污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用平均體重約80 g的健康鯉于河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。參照中國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)規(guī)定鎘濃度不超過(guò)0.005 mg/L。確定Cd2+的實(shí)驗(yàn)組濃度分別為0.005 mg/L Cd2+、0.05 mg/L Cd2+、0.5 mg/L Cd2+，另設(shè)一個(gè)對(duì)照組（清水）。將馴化后的鯉魚(yú)隨機(jī)平分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每3 d換1/2的水，每次加入不同濃度的CdCl2。每天兩次按照鯉魚(yú)體重的1.5%進(jìn)行投喂商業(yè)顆粒飼料，剩余的飼料殘?jiān)鼡瞥觯疁卦冢?8±2）℃，pH控制在7.0±0.1之間，飼養(yǎng)30 d。

1.2 樣品收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用濃度為40 mg/L的MS-222對(duì)所有魚(yú)進(jìn)行麻醉，每桶隨機(jī)選取5尾進(jìn)行稱重和體長(zhǎng)測(cè)量，并解剖分離出內(nèi)臟，液氮速凍后置于-80℃保存，用于不同組織脂肪酸的測(cè)定。另外，每桶隨機(jī)挑取3尾，取其肝臟，一部分置于4%多聚甲醛溶液中用于蘇木精-伊紅（HE）染色切片的制作，另一部分用于油紅染色切片的制作。

1.3 肝體比和臟體比測(cè)定

生長(zhǎng)及生物學(xué)性狀計(jì)算公式：

肝體比（hepato-somatic index，HIS，%)=Wl/Wt×100

臟 體 比 （viscera-somatic index，VSI，%）=Wv/Wt×100

式中，Wt為終末體質(zhì)量(g)，Wl為肝臟濕重（g）。

1.4 組織切片制作

每桶隨機(jī)挑取3尾，取其肝臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，參照《臨床病理學(xué)技術(shù)》中的操作規(guī)范，對(duì)鯉肝臟組織樣品進(jìn)行石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精－伊紅(HE)染色及油紅染色，并于顯微鏡下閱片觀察鯉肝組織的形態(tài)變化。

1.5 不同組織脂肪酸含量分析

每個(gè)樣品稱取2.0-3.0 g，每組做4個(gè)重復(fù)。用氯仿/甲醇(2:1,v/v)溶液萃取樣品中脂質(zhì)，使用美國(guó)Agilent 7890B氣相測(cè)譜儀（配置100 m HP-88石英毛細(xì)管柱）測(cè)定肝臟和肌肉全脂的脂肪酸成分，采用百分比的方法計(jì)算組織中脂肪酸含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL 2019分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0的單因素方差對(duì)生長(zhǎng)性能指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較；此外，由于脂肪酸提取過(guò)程中少量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)缺失，致使各組織脂肪酸數(shù)據(jù)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)不完全一致（非均衡數(shù)據(jù)），無(wú)法用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，因此使用SAS9.0軟件包對(duì)肌肉和肝臟脂肪酸成分進(jìn)行最小二乘分析和多重比較，不同組織脂肪酸成分表示為最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(LSMEAN±SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對(duì)鯉肝體比及臟體比的影響

肝臟是魚(yú)類代謝的主要器官，肝體比和臟體比是毒理實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)，能夠反映臟器的健康狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了鯉的肝體比與臟體比（表1），隨著水體中鎘濃度的增加，肝體比逐漸降低。當(dāng)水體鎘濃度為0.05 mg/L時(shí)，鯉魚(yú)的臟體比顯著低于對(duì)照組和0.005 mg/L處理組中的對(duì)應(yīng)值。與之類似，當(dāng)水體中鎘濃度從0.05 mg/L增加至0.5 mg/L時(shí)，鯉魚(yú)臟體比顯著升高。

表1 鎘暴露對(duì)鯉肝體比和臟體比的影響

2.2 鎘對(duì)鯉魚(yú)肝細(xì)胞形態(tài)和脂質(zhì)蓄積的影響

為了檢測(cè)鎘暴露是否會(huì)對(duì)鯉肝細(xì)胞造成損傷以及肝組織脂質(zhì)蓄積，本實(shí)驗(yàn)取了鯉的肝臟組織，分別使用蘇木精-伊紅（HE）和油紅染色檢測(cè)分析鯉肝細(xì)胞形態(tài)、肝脂沉積的情況。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，不同濃度鎘暴露之后鯉魚(yú)肝細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核處于細(xì)胞中心位置，肝細(xì)胞大小無(wú)明顯變化，細(xì)胞核大小無(wú)明顯變化且肝臟脂滴無(wú)明顯增多（圖1）。說(shuō)明鎘處理并未影響肝臟的脂肪蓄積。

圖1 鎘暴露對(duì)鯉肝細(xì)胞形態(tài)和脂肪含量的影響(10×40)

2.3 鎘對(duì)鯉魚(yú)肝臟及肌肉脂肪酸成分及含量的影響

脂肪酸的合成與分解代謝在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)過(guò)程中起著重要作用，且脂肪酸在脂質(zhì)的合成、分解和轉(zhuǎn)化的過(guò)程中有重要的調(diào)控作用，為了探討鎘暴露對(duì)鯉脂肪酸代謝的影響，本實(shí)驗(yàn)分析了不同濃度鎘暴露后鯉關(guān)鍵脂代謝組織肝臟和脂肪主要蓄積組織肌肉中的脂肪酸成分和含量。

分析鯉肝臟脂肪酸組成成分發(fā)現(xiàn)（表2，圖2），不同濃度鎘暴露后對(duì)鯉肝臟C16:0、C18:1n9、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:3n6、C20:4n6、C22:6n3、∑SA、∑PUFA/∑SA和∑N6/∑N3均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，0.005 mg/L與0.05 mg/L鎘暴露顯著降低了鯉肝臟C14:0的含量；0.005 mg/L組鯉肝內(nèi)C16:1n7含量增加，但隨著水體中鎘濃度的增加，其含量逐漸降低；0.005 mg/L組鯉肝內(nèi)C18:1n7含量顯著高于0.05 mg/L組（P＜0.05），但與其他各組差異不顯著（P＞0.05）；0.05 mg/L鎘暴露后，鯉肝內(nèi)C18:2的含量顯著高于其它組（P＜0.05）；隨水體中鎘濃度的增加，鯉肝內(nèi)C20:5n3的含量逐漸增加，0.5 mg/L組鯉肝內(nèi)C20:5n3含量顯著高于對(duì)照組和0.005 mg/L組對(duì)應(yīng)含量（P＜0.05）；0.05 mg/L組鯉肝臟∑PUFA的含量顯著高于對(duì)照組和0.005 mg/L組（P＜0.05）。

表2 不同濃度鎘對(duì)鯉魚(yú)肝臟脂肪酸含量的影響

分析鯉肌肉脂肪酸組成成分發(fā)現(xiàn)（表3，圖2），不同濃度鎘暴露后對(duì)鯉肌肉C14:0、C16:0、C16:1n7、C18:0、C18:1n9、C18:1n7、C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:4n6、∑SA、∑PUFA、∑PUFA/∑SA、∑N6和∑N6/∑N3均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；0.5 mg/L鎘暴露后，肌肉中C20:3n6的含量顯著高于0.05 mg/L組（P＜0.05），0.005 mg/L和0.05 mg/L組鯉肌肉C20:3n6低于對(duì)照組，但并無(wú)顯著差異（P＞0.05）；隨水體中鎘濃度的增加，鯉肌肉C22:6n3的含量逐漸增加，0.05 mg/L組鯉肌肉C22:6n3顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但當(dāng)濃度超過(guò)0.05 mg/L之后，肌肉中其含量降低。0.5 mg/L組肌肉∑N3含量顯著低于0.05 mg/L組（P＜0.05），0.05 mg/L和0.005 mg/L與對(duì)照組鯉肌肉∑N3無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

此外，分析肝臟和肌肉各對(duì)照組中脂肪酸含量發(fā)現(xiàn)，肌肉中C14:0、C16:0、C18:0含量顯著低于肝臟中的含量（P＜0.05）；同時(shí)，肌肉中∑SA顯著低于肝臟中的值（P＜0.05）（圖2）。但兩組織中∑PUFA含量差異不顯著。

圖2 鎘對(duì)鯉魚(yú)肝臟及肌肉脂肪酸成分的影響

3 討論

鎘在自然界中普遍存在，作為人體蛋白質(zhì)主要來(lái)源之一，魚(yú)體中的鎘會(huì)隨食物鏈最終進(jìn)入到人體，危害人體的健康。研究發(fā)現(xiàn)，人攝入鎘后，鎘主要蓄積在人體肝臟和腎臟內(nèi)，并對(duì)多種器官造成負(fù)面影響。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究也發(fā)現(xiàn)，將小鼠的肝細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的鎘暴露后，隨著鎘濃度的升高，肝細(xì)胞的死亡率逐漸增加[9]。水生動(dòng)物普遍可以吸收鎘，鎘不僅會(huì)對(duì)水生生物的生長(zhǎng)及存活帶來(lái)不利影響，還會(huì)對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)造成阻礙。已有的水生生物研究發(fā)現(xiàn)，1.6 mg/L鎘暴露30 d后，鯽魚(yú)肝組織超氧化物歧化酶顯著降低[10]，鎘濃度從0.2 mg/L增加至1.6 mg/L時(shí)，鯽魚(yú)肝丙二醛（MDA）的含量逐漸增加[11]，表明鎘暴露能夠引起紅鯽脂質(zhì)過(guò)氧化肝損傷，從而損害魚(yú)體健康。鎘暴露5周后，雄性食蚊魚(yú)肝質(zhì)量和肝腺指數(shù)有所增大，但對(duì)雌性食蚊魚(yú)無(wú)顯著影響[12]。0.025 mg/L鎘暴露12周后，稀有鮈鯽內(nèi)臟團(tuán)重顯著降低[13]。

與上述研究不同，本實(shí)驗(yàn)中，隨著水體中鎘濃度的增加，肝體比逐漸降低，當(dāng)水體鎘濃度為0.05 mg/L時(shí)，鯉魚(yú)的肝體比顯著低于對(duì)照組和0.005 mg/L處理組。且臟體比有類似趨勢(shì)。這可能與不同種的魚(yú)類對(duì)鎘的毒性具有不同的敏感性有關(guān)。

此外，經(jīng)過(guò)鎘暴露的小鼠肝臟與對(duì)照組小鼠肝臟相比，出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象[14]。0.005 mg/L與0.025 mg/L鎘暴露后，稀有鮈鯽肝組織形態(tài)與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，0.05 mg/L時(shí)，肝臟開(kāi)始出現(xiàn)病變[13]。在本實(shí)驗(yàn)中鎘暴露對(duì)鯉肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化，推測(cè)可能原因?yàn)辄S河鯉對(duì)鎘暴露的耐受強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)中鎘暴露濃度不足以導(dǎo)致肝脂質(zhì)的蓄積及肝損傷。

鎘暴露對(duì)脂肪酸代謝有很大影響，且存在復(fù)雜的相互作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，鎘(300 mg/L，暴露6周)上調(diào)了魚(yú)肝臟長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶elovl2活性，但這種上調(diào)并沒(méi)有伴隨著多不飽和脂肪酸的顯著增加，且300 mg/L鎘暴露后并沒(méi)有顯著影響虹鱒肝臟脂肪酸含量[15]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中肝臟和肌肉中脂肪酸含量基本相符。