耿 佳，劉 芬，曹 瑩，3，邢 遠(yuǎn)，3，王雪梅，，3

（1.西安醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生學(xué)教研室，陜西 西安 710021；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物疾病模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；3.陜西省公共安全醫(yī)學(xué)防控研究中心，陜西 西安 710021）

據(jù)估計(jì)，全世界年齡在20～79 歲人群中，有4.15 億是糖尿病患者，每年約有500 萬人死于糖尿病及其并發(fā)癥，糖尿病相關(guān)疾病的醫(yī)療費(fèi)用估計(jì)為6730 億美元。此外，截止2025 年，糖尿病患者將增至5.6 億，約占全球人口的7%。現(xiàn)階段臨床上主要通過綜合治療控制血糖，但是大多數(shù)2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者的血糖控制并不理想，易造成心、腦、腎等系統(tǒng)出現(xiàn)并發(fā)癥，疾病預(yù)后較差，病死率較高[1]。當(dāng)前醫(yī)學(xué)認(rèn)知認(rèn)為T2DM 是由于多種遺傳易感因素、環(huán)境和行為因素的相互作用所導(dǎo)致的，各種因素如何發(fā)揮作用有待進(jìn)一步闡明[2]?？崭寡獫{葡萄糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BS）和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）是糖尿病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明[4]，lncRNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，作為遺傳易感因素，從基因水平轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)能量代謝，成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。同時(shí)，人體2 型糖尿病相關(guān)的許多單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)都是坐落在lncRNA 區(qū)域內(nèi)，其中長鏈非編碼RNA 心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（myocardial infarction-associated transcript，MIAT）在急性心梗和T2DM 及其并發(fā)癥中的表達(dá)都存在顯著差異[5]。不同于mRNA，lncRNA 作為生物標(biāo)志物有自身的優(yōu)勢，其本身就是功能分子，其的表達(dá)水平能更好地反映疾病狀態(tài)，其表達(dá)模式高度特異，提示其表達(dá)狀態(tài)可以被用于某些疾病的精細(xì)分期或分類。因此，本研究從基因水平分析lncRNA MIAT 與臨床指標(biāo)之間的聯(lián)系，作為T2DM診斷標(biāo)志物的價(jià)值及參與調(diào)控T2DM 的機(jī)制，為T2DM 的尋找新的生物診斷和治療靶點(diǎn)，提供有價(jià)值的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年8 月～2018 年2 月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院入院進(jìn)行就診的100例漢族T2DM 患者作為T2DM 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2013 年中國糖尿病防治指南公布的2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血漿葡萄糖≥7.0 mmol/L 或口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）后2h 血糖≥11.1 mmol/L 或既往有確切糖尿病病史、正在使用降糖藥物或胰島素者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他特殊類型糖尿?。虎趷盒阅[瘤；③慢性炎癥等相關(guān)疾病；④嚴(yán)重的心肝肺腎等疾病；⑤自身免疫性疾病。選擇同期在該院進(jìn)行就診的漢族非T2DM 患者作為對照組，共100 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：空腹血漿葡萄糖＜6.1 mmol/L 和OGTT 后2h 血糖＜7.8 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往診斷為2 型糖尿病；②合并其他內(nèi)分泌疾?。虎蹛盒阅[瘤；④急、慢性感染及嚴(yán)重傳染性疾病患者；⑤嚴(yán)重的心肝肺腎等疾??；⑥自身免疫性疾病。所有研究對象均為無血緣關(guān)系并且在新疆地區(qū)長久居住的常住人口，排除了環(huán)境差異而引起的基因變異。本研究方案經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均自愿簽署書面知情同意書。

1.2 血生化指標(biāo)的測定 采集兩組清晨空腹抽取靜脈血5 ml，全血樣本在室溫下保存30 min，以使血液凝固。樣品在4 ℃下3000 r/min 離心10 min 分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測包括FPG、餐后2h 血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血尿酸、肌酐、尿素等生化指標(biāo)。生化指標(biāo)均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心統(tǒng)一測定。

1.3 外周血RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 將3～5 ml 肝素抗凝全血樣品以3500 r/min 離心10 min，用淋巴細(xì)胞分離液（Solarbio，中國）分離單核細(xì)胞，將分離出來的單核細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的D-Hanks 緩沖液沖洗2次，離心沉淀后加入l ml 細(xì)胞裂解液（Trizol，Invitrogen，USA），置于冰上反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞至混勻。常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，按照試劑說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（Thermo，USA）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測lncRNA 的表達(dá) 檢測 lncRNA MIAT 的編號、lncRNA 的位置和擴(kuò)增引物見表1。按照SYBR GREEN 試劑盒（Applied Biosystems，USA）說明書，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（500 HT Fast real-time PCR system，BIO-RAD，USA）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)測定相關(guān)RNA 分子的表達(dá)。

表1 選取的T2DM 相關(guān)lncRNAs 分子的位置和實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（）表示，計(jì)數(shù)資料用（n）和（%）表示，做χ2檢驗(yàn)。連續(xù)型變量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法，△CT=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值，△△CT=T2DM 組△CT 值－對照組△CT 值。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman 法檢測，ROC 曲線法分析其作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值。多變量Logistic 回歸分析MIAT 與T2DM 的關(guān)系，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、體重指數(shù)、舒張壓、尿素、肌酐和尿酸比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組高血壓、收縮壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、空腹血糖和餐后2 h 血糖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組一般資料比較[，n（%）]

表2 兩組一般資料比較[，n（%）]

注：a 代表連續(xù)型變量的比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，b 代表計(jì)數(shù)資料用χ2 檢驗(yàn)

2.2 外周血中l(wèi)ncRNA MIAT 的表達(dá) 通過檢測lncRNA MIAT 在T2DM 組和對照組的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者的外周血中MIAT 的表達(dá)顯著升高，差異表達(dá)倍數(shù)是（1.90±0.85）vs（1.11±0.66）（P=0.004）。

2.3 評價(jià)MIAT 作T2DM 生物標(biāo)志物的價(jià)值 通過ROC 曲線分析，MIAT 的AUC 為0.753（95%CI=0.689～0.817）見圖1，MIAT的最佳臨界點(diǎn)的是0.950，相應(yīng)的靈敏度是0.970，特異度是0.470，95%CI=0.686～0.820。進(jìn)行多變量Logistic 回歸分析，進(jìn)一步驗(yàn)證MIAT 是T2DM 的危險(xiǎn)因素 [OR=1.527，95%CI=1.130～1.919]，見表3。進(jìn)一步檢測了lncRNA MIAT 表達(dá)與糖尿病危險(xiǎn)因素、血糖水平指標(biāo)之間的相關(guān)性。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果表明，lncRNA MIAT 的變化與高血壓、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、糖耐量呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

圖1 lncRNA MIAT 的曲線下面積

表3 多元回歸分析糖尿病患病危險(xiǎn)因素

表4 糖尿病人外周血單核細(xì)胞中MIAT 的表達(dá)和糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素、血糖參數(shù)的相關(guān)性

表4（續(xù)）

3 討論

T2DM 是一組以血糖濃度升高為特征的代謝紊亂[6]。本研究中T2DM 組lncRNA MIAT 對照組表達(dá)較增加（P＜0.05），表明lncRNA MIAT 對于T2DM 有一定的診斷價(jià)值。近年來，lncRNA 作為T2DM 的生物標(biāo)志物和新的干預(yù)治療靶點(diǎn)研究是新的追蹤熱點(diǎn)[7，8]。lncRNA 生物標(biāo)志物在循環(huán)水平上較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物更穩(wěn)定，檢測靈敏度更高[9，10]?？捎胵RT-PCR檢測RNA 的微量表達(dá)，作為疾病診斷的輔助指標(biāo)[11]。

心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本lncRNA MIAT 位于人22號染色體上，是T2DM 的敏感部位，MIAT 水平與T2DM 呈正相關(guān)[9]。高糖血癥能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞MIAT表達(dá)水平增加，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中MIAT和NF-κBp-p65 表達(dá)增加[12]。體外實(shí)驗(yàn)顯示MIAT 敲除能夠緩解糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜的新血管形成，血管滲漏和炎癥[13]。本研究與既往研究結(jié)果一致，MIAT與糖尿病發(fā)病呈正相關(guān)，且進(jìn)一步探討了其相關(guān)性和診斷價(jià)值。通常根據(jù)ROC 中的AUC 數(shù)值、特異性和敏感性數(shù)值來判斷檢測指標(biāo)是否具有診斷價(jià)值，盡管研究中MIAT 的AUC 值是0.753，但也是具有巨大潛力和價(jià)值的診斷標(biāo)志物（0.7～0.8 良好；0.6～0.7有效）[14，15]。糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中MIAT 的表達(dá)和低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血糖參數(shù)與MIAT 的表達(dá)呈正相關(guān)，且具有顯著差異性，提示MIAT 的表達(dá)和脂質(zhì)代謝與血糖水平密切相關(guān)。

綜上所述，在疾病的病理發(fā)生中l(wèi)ncRNA 分子發(fā)揮著重要的作用，探討其在疾病病理發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，對于疾病的干預(yù)和治療有著重要的意義。對lncRNAs 的進(jìn)一步研究將促進(jìn)心血管疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，探討了MIAT 在全血樣本的外周血單核細(xì)胞的表達(dá)，還未檢測血清中MIAT 的表達(dá)，兩者表達(dá)和作用途徑是否相同有待進(jìn)一步探明。PBMCS 中的lncRNA MIAT 可能是診斷AMI 的有效生物標(biāo)志物，探討其調(diào)控機(jī)制可能成為T2DM 治療的一個(gè)潛在應(yīng)用方向。