饒大龐，項之洋，虞海峰

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027

前列腺癌是第二常見的男性惡性腫瘤，也是男性癌癥死亡的第四大原因[1]。亞洲男性前列腺癌的發(fā)病率和病死率在過去幾十年里迅速上升，大多數患者就診時已為晚期[2]。本課題檢測cGMP依賴蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase type I，PRKG1）在前列腺癌中的表達，研究PRKG1敲除對前列腺癌細胞的影響，為探尋前列腺癌新的治療靶標提供思路[3]。

1 材料和方法

1.1 材料 75例前列腺癌組織和12例正常前列腺組織及相關臨床資料由西安艾麗娜生物科技有限公司提供，包括PRKG1表達組織芯片免疫組化結果、前列腺癌的臨床病理特征（組織病理學和組織學分級）。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）第8版。病理特征評價采用Gleason評分。本研究通過溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準（倫理審批號：2021-K-01-01）。

抗PRKG1、β-微管蛋白（β-Tubulin）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、埃茲蛋白（Ezrin）、鈣黏附蛋白-2（cadherin-2，CDH-2）、Bax、Bcl-2及鈣黏附蛋白-1（cadherin-1，CDH-1）的一抗購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗（pv6001）購自北京中衫金橋公司。細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司。人前列腺癌細胞系22RV1購自上海烜雅生物科技有限公司。攜帶Cas9和gRNA的質粒載體由杭州擎科生物科技有限公司構建及驗證。CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所。DAB顯色試劑盒20×（ZLI-9018）購自北京中衫金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：組織微陣列玻片的HE染色采用標準程序進行。載玻片經二甲苯脫蠟、乙醇漂洗、重新水化。抗原修復采用枸櫞酸緩沖液。將陣列浸泡在3%過氧化氫緩沖液中30 min來淬滅內源性過氧化物酶。用PRKG1一抗（1:50）孵育后，4 ℃過夜（16～18 h）。37 ℃水浴復溫30 min，PBS浸泡5 min 3遍。滴加二抗，常溫20 min；PBS浸泡5 min 3遍。DAB顯色，隨后自來水沖洗。蘇木素復染20 s，自來水沖洗。浸入PBS溶液3～5 s返藍；立即蒸餾水沖洗。依次浸泡75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各5 min，二甲苯中各10 min脫水。切片上滴加中性樹膠，蓋玻片覆蓋，封片。

每個標本均在光學顯微鏡（BX40，日本奧林帕斯）下檢查，以確定組織病理學特征和抗PRKG1免疫反應性。由兩位資深病理醫(yī)師雙盲評分，結果一致者為最后判定結果。免疫組化結果判定[4]：陽性染色定位于細胞漿，采用下述方法對免疫組化染色結果進行半定量分析：首先按陽性強度評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕色；再將陽性細胞數評分：無陽性細胞為0分，0～10%為1分，10%～50%為2分，≥50%為3分。綜合陽性強度和陽性細胞數評分：兩者的乘積為最后得分，得分＞5分為陽性，≤5分為陰性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：人前列腺癌細胞系22RV1培養(yǎng)于RPMI1640含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，37 ℃，5%CO2孵育。以每孔4×105個細胞種入6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液。用0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗，顯微鏡下細胞計數并調整濃度。

1.2.3 CRISPR/Cas9敲除：首先利用CRISPR/Cas9技術在22RV1細胞中敲除PRKG1的表達。將已建立的菌落命名為22RV1-KO，并以22RV1細胞（22RV1-CON）為對照。用于構建人類PRKG1基因gRNA 2個引物包括PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-F1：5"-CACCGACATCGG CCCGCGGACCACC-3"、PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-R1：5"-AAACGGTGGTCCGCGGGCCGATGTC-3"和PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-F2：5"-CACCGTCCTTCCACGACCTGCGCC-3’、PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-R2：5"-AAACGGCGCAGGTCGTGGAAGGAC-3"。根據生產廠家的操作規(guī)程，將攜帶cas9和2個gRNA的質粒轉染導入22RV1細胞，獲得穩(wěn)定的22RV1-KO細胞系。另外將單純cas9的對照組質粒轉染導入22RV1細胞獲得穩(wěn)定的22RV1-CON對照組細胞系。轉染3 d后，在96孔板上以0.5個細胞/孔為單位進行限制稀釋法。當細胞達到70%融合度時，用100 μmol/L PMSF的細胞裂解液裂解細胞。用Western blot法檢測每個克隆的PRKG1蛋白表達。隨后使用PRKG1蛋白非表達克隆進行實驗。

1.2.4 細胞增殖：用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況。將細胞以1 000個/孔的密度接種到96孔板中。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃，5% CO2孵育2 h。在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 遷移和侵襲：遷移和侵襲通過Transwell實驗檢測，小室底膜的上室表面涂覆并放置在37 ℃下30 min。細胞（2×105）懸浮在500 μL無血清培養(yǎng)基中，加入上室。下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。24 h后用3.7%多聚甲醛固定膜上的浸潤性細胞，結晶紫染色，在400倍顯微鏡下計數。細胞侵襲能力也用同樣的方法進行檢測，但時間設為48 h。隨機選擇7～10個區(qū)域來手動計數侵襲和遷移細胞的數量，并計算平均值。

1.2.6 Western blot：收集細胞加入含有100 μmol/L PMSF的細胞裂解液，4 ℃、13 500 r/min離心10 min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白，經10% SDS-PAGE電泳分離后電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入抗MMP9（1:1 000）、Ezrin（1:1 000）、CDH-2（1:1 000）、Bax（1:1 000）、Bcl-2（1:1 000）、CDH-1（1:1 000）和GAPDH（1:1 000）4 ℃過夜，洗膜后，加入二抗室溫溫育1 h。ECL化學顯色，ImageJ（v1.8.0）軟件分析蛋白條帶。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗結果重復3次。計量資料采用±s表示，2組間比較采用獨立t檢驗；計數資料采用例和率表示，2組間比較采用χ2檢驗；2組細胞增殖曲線采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRKG1在前列腺癌組織中的表達及其與臨床分期和Gleason評分的關系 在PRKG1陽性表達方面，主要在細胞胞漿內觀察到棕黃色染色，表明PRKG1高表達（見圖1）。組織芯片免疫組化分析結果顯示，與正常前列腺組織組[41.7%（5/12）]相比，PRKG1在前列腺癌組織[13.3%（10/75）]中陽性率顯著降低（P=0.026），并且不同腫瘤臨床分期和不同Gleason評分前列腺癌組織的PRKG1陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 PRKG1在前列腺癌組織和正常前列腺組織中的表達情況

表1 前列腺癌組織PRKG1表達與臨床分期及Gleason評分的關系[例（%）]

2.2 CRISPR/Cas9介導的PRKG1基因敲除促進細胞增殖、遷移和侵襲 Western blot結果顯示，22RV1-KO組細胞不表達PRKG1，表明22RV1-KO組細胞中PRKG1基因敲除成功（見圖2）。細胞增殖實驗表明，與22RV1-CON組細胞相比，22RV1-KO組細胞的增殖水平增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。Transwell試驗結果進一步證實，與22RV1-CON組細胞相比，22RV1-KO組細胞遷移及侵襲能力均加強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.3 PRKG1基因敲除對細胞凋亡蛋白、MMP9、細胞黏附蛋白及細胞骨架連接蛋白表達水平的影響 與22RV1-CON組細胞相比，22RV1-KO組細胞MMP9、CDH-1、Bax蛋白相對表達量降低（P＜0.05），CDH-2、Bcl-2蛋白相對表達量升高（P＜0.05），而Ezrin蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖2 Western blot確認22RV1細胞的PRKG1基因敲除結果

圖3 PRKG1基因敲除對22RV1細胞增殖的影響

3 討論

PRKG是廣泛存在于真核生物中的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在哺乳動物細胞中發(fā)現了兩種主要形式的PRKG：PRKG1和PRKG2[5]。過去的研究證明，與正常組織相比，部分腫瘤組織中PRKG1水平降低，且PRKG1通過蛋白的磷酸化影響細胞的活動[6]。人類集成蛋白質表達數據庫（the Human Integrated Protein Expression Database，HIPED）提示PRKG在外周血單核細胞和前列腺正常組織中過表達。越來越多的證據表明，PRKG是可能誘導癌細胞凋亡的一種新的分子途徑[7-8]。

圖5 2組細胞MMP9、Ezrin、CDH-2、Bax、Bcl-2、CDH-1蛋白相對表達量比較

另外有研究表明，某些抑癌基因，例如TCF12可通過cGMP-PRKG通路抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[9]。但也有研究表明，TMPRSS2-ERG基因融合可導致ERG致癌通路異常激活，強化前列腺癌細胞cGMP合成，導致PRKG活性增強引起細胞增殖[10]。

前列腺癌發(fā)病機制是多種遺傳因素共同參與的[11]。有研究表明PRKG1是前列腺癌進展過程中的一個抑癌基因[9]。我們觀察到在前列腺癌組織中PRKG1較正常前列腺組織低表達，這些結果與PRKG1的抗增殖和抗腫瘤作用是一致的[12]。磷酸化是一種表觀遺傳學的機制，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7，13]，部分通路激活PRKG1可誘導前列腺癌的細胞凋亡，抑制前列腺癌細胞遷移[9，14]。舒林酸及其衍生物可能通過激活PRKG誘導細胞凋亡以預防結直腸癌、前列腺癌和乳腺癌[15-16]。

圖4 PRKG1基因敲除對22RV1細胞遷移及侵襲能力的影響（×400）

本研究采用CRISPR/Cas9方法敲除PRKG1基因，發(fā)現在22RV1前列腺癌細胞中PRKG1基因的敲除降低了PRKG1的表達，同時敲除PRKG1基因后腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力均上調，Western blot實驗也發(fā)現了部分凋亡蛋白在22RV1-KO細胞系中表達的異質性。MMP9、CDH-1、Bax蛋白在22RV1-KO細胞克隆中表達下降，CDH-2、Bcl-2水平升高。MMP9雖是促癌基因，但在22RV-1中表達降低，這可能是由于cGMP激活中由NO模仿介導的炎癥反應中，在基因水平上也降低了MMP9造成[17]。CDH-1、Bax抑制癌細胞增殖和遷移[18-19]，在本研究中22RV1-KO細胞克隆敲除后CDH-1、Bax表達下降，驗證了PRKG1是抑制前列腺癌生長與轉移的。有研究報道，CDH-1可抑制惡性腫瘤發(fā)展，與BRAF、Src、AKT等多條癌癥相關信號通路存在相互作用，靶向CDH-1策略已成為當前腫瘤防治研究突破新方向[20]。CDH-2是一種促進惡性腫瘤的基因[21]，CDH2介導的細胞黏附是生存信號的重要中介，并抑制了細胞的凋亡[22]。本研究PRKG1敲除后，同時通過下調上皮細胞標志物CDH-1與上調間質標志物CDH-2來影響前列腺癌細胞的遷移與侵襲能力。已有研究發(fā)現有關細胞凋亡基因分為以Bax為代表的促進細胞凋亡的基因和以Bcl-2為代表一致細胞凋亡的基因[23]。我們的結果中凋亡蛋白Bcl-2抑制和促進凋亡蛋白Bax升高，與我們的研究預期相符。促癌基因Ezrin比值變化差異無統(tǒng)計學意義，可能與PRKG1基因無明顯相關性。

本研究結果證明了PRKG1的重要性，并為其作為前列腺癌治療藥物靶點提供了基礎。但研究還有很大的局限性。例如，組織芯片中并沒有患者生存期信息，研究敲除PRKG1影響的蛋白種類有限，未研究PRKG1過表達對前列腺癌細胞的影響，缺少動物實驗等。我們認為，這個基因還需要更深入的研究評估，以便更好地理解其治療潛力。