王 晨，鄒青旭，姜靜遠(yuǎn)，張春玲，林風(fēng)武*

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春 130033；2.吉林大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130000）

胸壁缺損患者一直飽受疾病的折磨，胸壁缺損的治療也成為廣大醫(yī)療工作者面臨的一個(gè)難題[1]。胸壁腫瘤根治術(shù)后的患者，一般會(huì)出現(xiàn)大面積的胸壁缺損[2]。除此之外，交通事故、高墜傷等外傷中大多數(shù)伴有肋骨骨折，比例達(dá)85%[3]。肋骨骨折的患者胸廓缺乏肋骨的支撐，容易出現(xiàn)反常呼吸活動(dòng)以及呼吸道感染。若損傷嚴(yán)重，甚至?xí){到患者的生命安全[4-5]。因此，一般對(duì)上述患者進(jìn)行胸廓重建，修復(fù)患者胸廓原有的外觀及胸壁的完整性，以維持胸腔內(nèi)封閉、負(fù)壓的環(huán)境，保證呼吸運(yùn)動(dòng)的正常進(jìn)行[6]。合適的胸壁替代物是胸壁重建成功的關(guān)鍵。研究[7-8]顯示，對(duì)于胸壁缺損范圍較大者，目前大多數(shù)臨床醫(yī)生建議優(yōu)先選用可吸收生物材料進(jìn)行修補(bǔ)。

“三明治”式結(jié)構(gòu)既綜合了條狀、板狀材料硬的特點(diǎn)，又吸納了網(wǎng)狀材料軟的優(yōu)點(diǎn)，是目前胸壁缺損替代物的最佳方案[9]。但目前臨床上用于“三明治”式結(jié)構(gòu)的人工材料難以滿足多樣化需求。隨著科技的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)人工高分子材料可媲美天然高分子材料，其在外科學(xué)中受到重視[10-12]。研究表明，聚乳糖（PLLA）和和殼聚糖（CHS）兩種材料在體內(nèi)具有良好的溶解性，且殼聚糖具有價(jià)格便宜、貯量較多、降解性能良好等優(yōu)點(diǎn)，與聚乳糖有誘發(fā)非感染性炎癥的風(fēng)險(xiǎn)及價(jià)格高昂的缺點(diǎn)相中和，具有一定的使用前景[13]。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)

觀察性實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

2020年3月－9月于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。

1.3 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ：由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，10只7～9周齡家兔，體質(zhì)量2.0～2.7 kg，平均（2.4±0.1）kg。將10只家兔分為2組，每組各5只。2組家兔分開進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)完全遵守規(guī)范家兔飼養(yǎng)，各項(xiàng)操作均按《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行[14-15]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

聚乳酸纖維（PLLA）和殼乳糖纖維（CHS）交織織物的制作，由吉林大學(xué)材料學(xué)院提供。

1.4.1 聚乳酸（PLLA）/聚己內(nèi)脂（PCL）復(fù)合材料（人工肋骨板）的制備 將PLLA和PCL切片按一定比例混合，加入到準(zhǔn)備好的模具中加溫，溫度上升至200 ℃時(shí)開始加壓，加壓至10 Mpa。在此溫度和壓強(qiáng)下維持10 min，待聚合物充分反應(yīng)后立即冷卻，脫模取樣。再將試樣放入平板模具腔中，在80℃下預(yù)熱5 min后，逐漸加壓至8 Mpa。維持該溫度與壓力10 min，然后慢慢冷卻，至室溫時(shí)將材料取出。

1.4.2 新型“三明治”胸壁替代材料的制作 取制備好的聚乳酸纖維和殼乳糖纖維交織織物上下各一層覆蓋于已制好的人工肋骨板表面，制成新型“三明治”型人工胸壁替代材料。

1.4.3 新型PLLA和CHS復(fù)合交織織物的性能 1）力學(xué)性能檢測(cè)：使用材料試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)復(fù)合交織織物力學(xué)性能。2）復(fù)合織物表面形態(tài)觀察。3）交織織物與細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)：將一片充分浸潤后的復(fù)合交織織物置于細(xì)胞培養(yǎng)板上。然后將每毫升1×106個(gè)細(xì)胞濃度的成骨細(xì)胞（細(xì)胞株是由中科院上海細(xì)胞研究所提供的Hfob1.19 SV 40 轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞）懸液加于培養(yǎng)板復(fù)合材料的表面。然后將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱（日本SAYAN公司）中培養(yǎng)。觀察成骨細(xì)胞在復(fù)合材料上的存活情況、細(xì)胞形態(tài)及相互之間相容性。

1.4.4 聚乳酸（PLLA）/聚己內(nèi)酯（PCL）共混板材（人工肋骨板）的性能 彎曲性能測(cè)定：參照GB/T16419-1996規(guī)定的試樣尺寸20 mm×3 mm×1 mm，跨度L=16 h，在15 ℃，濕度68%，實(shí)驗(yàn)速度2.5 mm/min的測(cè)試條件下測(cè)量，測(cè)量儀器為上海華龍測(cè)試儀器廠生產(chǎn)的微機(jī)電子萬能試驗(yàn)機(jī)。

1.4.5 新型“三明治”胸壁替代材料的性能 1）急性全身毒性實(shí)驗(yàn)：10只大鼠，隨機(jī)分為2組。實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)靜脈注射上述所有受試材料的浸泡液，劑量50 mL·kg-1。對(duì)照組大鼠采用0.9%生理鹽水按同樣的方式經(jīng)靜脈注射，劑量與實(shí)驗(yàn)組保持一致。觀察實(shí)驗(yàn)大鼠在注射后的反應(yīng)情況，包括大鼠的一般狀態(tài)、不良反應(yīng)和有無致死情況（分別于1 d后、2 d后、3 d后各觀察記錄1次）。2）體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)：新西蘭白兔1只，麻醉后沿兩側(cè)腹部劃開皮膚，分離肌層后將備好的各類受試材料放入，共4組。于術(shù)后4、8、12、24周時(shí)，分別取出之前備好的1、2、3、4組材料組織及周圍纖維包膜和軟組織，觀察新型復(fù)合材料溶解情況。3）細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)：將受試材料和其他陽性、陰性對(duì)照材料分別置于6孔板中。取濃度為6×104·mL-1的第三代的豬骨髓干細(xì)胞細(xì)胞懸液3 mL加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，各組設(shè)置平行樣品6個(gè)。每天用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)，鏡下觀察受試材料表面及其邊緣細(xì)胞的形態(tài)和生長情況。4）溶血實(shí)驗(yàn)：在37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)保溫30 min。將按新鮮抗凝血:生理鹽水4:5的比例制成稀釋兔血0.2 mL放入提前備好的試管中，按試樣組、陽性、陰性對(duì)照組各設(shè)平行樣品5個(gè)，隨后將溶于生理鹽水中（5 g 置于10 mL 0.9%生理鹽水中）的試樣放入各試管內(nèi)。37℃恒溫水浴箱中保溫1 h后離心5 min，隨后取上清液在545 nm波長下測(cè)其吸光度[16]。

1.4.6 胸壁缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的創(chuàng)建及改良“三明治”胸壁替代材料性能 取實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)的10只家兔，麻醉后機(jī)械通氣。取前外側(cè)橫行切口用手術(shù)刀切開長約5 cm切口，用手指鈍性分離肌肉以暴露肋骨，然后將家兔第5、6肋骨連同肋間肌完整取出。實(shí)驗(yàn)組使用新型復(fù)合型人工胸壁材料進(jìn)行修補(bǔ)，補(bǔ)片四周用可吸收縫線縫合于周圍軟組織和肋骨斷端。表面將胸壁肌肉覆蓋縫合，隨后縫合皮膚。對(duì)照組將缺損兩側(cè)肌肉行單純間斷縫合。無菌紗布覆蓋、包扎。為預(yù)防感染，術(shù)后予家兔青霉素肌注處理。

1.5 主要觀察指標(biāo)

1）觀察新型聚乳酸纖維和殼乳糖纖維交織材料的力學(xué)性能、表面形態(tài)觀察、以及細(xì)胞在交織織物上能否正常生長，細(xì)胞與材料有無明顯排異現(xiàn)象；2）觀察聚乳酸（PLLA）/聚己內(nèi)酯（PCL）合成材料的彎曲性能；3）觀察新型復(fù)合型人工胸壁材料的急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料使用 χ2檢驗(yàn)，用率（%）表示；計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

所有實(shí)驗(yàn)家兔數(shù)據(jù)均被納入分析。

2.2 新型PLLA和CHS復(fù)合交織織物的力學(xué)性能測(cè)試

實(shí)驗(yàn)研究表明，PLLA/CHS混合織物的力學(xué)性能優(yōu)于單純的聚乳酸纖維織物（PLLA/CHS混合織物斷裂強(qiáng)力為28N，而PLLA織物為23N)。因此，新型PLLA和CHS復(fù)合交織織物的力學(xué)性能表現(xiàn)更優(yōu)秀。

2.3 新型PLLA和CHS復(fù)合交織織物的表面形態(tài)觀察

該實(shí)驗(yàn)分別間隔1個(gè)月取出實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行觀察，共觀察5次。觀察過程中發(fā)現(xiàn)，早期時(shí)變化并不明顯，至5個(gè)月時(shí)可見明顯的溶解表現(xiàn)。

2.4 新型PLLA和CHS復(fù)合交織織物與細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)3 d后在電鏡下觀察交織織物與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合交織織物纖維周圍附著有較多的成骨細(xì)胞，細(xì)胞成多角形，生長良好。表明新型交織織物能夠?yàn)榧?xì)胞提供附著和生長的環(huán)境。

2.5 聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混板材彎曲性能測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，PLLA/PCL共混材料的彎曲性能與人體組織接近，能給予機(jī)體足夠的骨性支撐。見表1。

表1 聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混板材彎曲性能測(cè)定結(jié)果

2.6 新型復(fù)合型人工胸壁材料的急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

分別于24、48、72 h對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行觀察及測(cè)質(zhì)量。所有大鼠均無死亡，無明顯毒性反應(yīng)（嘔吐、驚厥、呼吸抑制等反應(yīng)），飲食與大小便同前。監(jiān)測(cè)體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量略為增加，72 h監(jiān)測(cè)為（0.79±0.12）g，與對(duì)照組（0.67±0.14）g相比無較大差異（P＞0.05)。因此，我們認(rèn)為新型復(fù)合材料為無毒材料。

2.7 新型復(fù)合型人工胸壁材料的體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)

研究發(fā)現(xiàn)，新型復(fù)合材料在體內(nèi)約5周時(shí)質(zhì)地較前變軟，9周時(shí)材料在體內(nèi)溶解縮小，完全喪失骨性支撐。

2.8 新型復(fù)合型人工胸壁材料的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

鏡下發(fā)現(xiàn)觀察期內(nèi)細(xì)胞成多角形形態(tài)，生長良好。MTT比色結(jié)果顯示，OD值由開始時(shí)（1.016±0.012）逐漸升至（2.928±0.427），表明實(shí)驗(yàn)材料不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，新型材料安全可靠。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，見圖1。

圖1 連續(xù)6 d監(jiān)測(cè)細(xì)胞數(shù)目變化情況

2.9 新型復(fù)合型人工胸壁材料溶血實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用陰性對(duì)照組（吸光度＜0.03）和陽性對(duì)照組[吸光度（0.8±0.30）]吸光度均復(fù)合要求，且實(shí)驗(yàn)組溶血率為3.3%，符合國家對(duì)醫(yī)用生物材料的要求（溶血率＜5%），新型材料可安全使用。見表2。

表2 新型復(fù)合型人工胸壁材料溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 胸壁缺損動(dòng)物模型不同治療方案下恢復(fù)情況

實(shí)驗(yàn)組家兔精神狀態(tài)、飲食、大小便均正常，切口愈合良好，傷口處Ⅰ /甲級(jí)愈合。根據(jù)家兔術(shù)后引流量情況酌情拔管（約術(shù)后6～9 d），實(shí)驗(yàn)組5例家兔術(shù)后均未發(fā)現(xiàn)發(fā)燒、腹瀉癥狀。對(duì)照組家兔術(shù)后精神狀態(tài)、飲食情況稍差，但也無發(fā)燒、腹瀉等感染表現(xiàn)，引流管拔除及傷口處理情況與實(shí)驗(yàn)組相同。

3 討論

胸壁缺損的修復(fù)即修復(fù)胸壁原有骨性組織及修復(fù)原有軟組織結(jié)構(gòu)。首先，各種原因?qū)е碌墓切猿煞值膿p傷修復(fù)必須依靠有一定機(jī)械強(qiáng)度的人工材料支撐，恢復(fù)胸廓原有形態(tài)，防止反常呼吸，保護(hù)胸腔內(nèi)臟器。胸壁損傷進(jìn)行骨性重建，一般通過胸壁損傷的位置和大小來決定是否有必要。一般認(rèn)為，對(duì)于前胸壁損傷的患者，如果損傷范圍＜5 cm，則無須進(jìn)行骨性重建處理；對(duì)于后胸壁損傷的患者，如果損傷范圍＜ 10 cm或者單根或雙根的骨折，也無須進(jìn)行骨性重建[17-19]。此外，對(duì)于胸骨損傷以及胸壁全層損傷造成嚴(yán)重以及胸壁全層損傷，造成患者反常呼吸，呼吸困難者，也應(yīng)進(jìn)行骨性重建。人的胸廓本身是一個(gè)封閉、負(fù)壓環(huán)境，軟組織的重建對(duì)于維持該環(huán)境顯得尤為重要[20]。一般在術(shù)中多采用將損傷周圍組織與網(wǎng)狀人工材料進(jìn)行縫合[21]。胸壁修補(bǔ)術(shù)需考慮患者損傷情況、患者家庭經(jīng)濟(jì)水平以及醫(yī)療機(jī)構(gòu)水平等多個(gè)方面，目的是維持正常的胸廓形態(tài)、保護(hù)胸腔臟器、防止發(fā)生反常呼吸以及維持自身封閉和負(fù)壓環(huán)境。

胸壁缺損的人工胸壁復(fù)合材料選擇非常重要：復(fù)合材料要有良好的生物相容性，不會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；復(fù)合材料要有骨性材料特點(diǎn)，對(duì)骨性缺損部位產(chǎn)生一定支撐作用；材料易于降解，避免長時(shí)間殘留于機(jī)體內(nèi)引起感染；材料性質(zhì)穩(wěn)定，在材料的加工制作、運(yùn)輸使用時(shí)不易發(fā)生變性；材料能提供易于細(xì)胞附著和生長的環(huán)境；對(duì)患者術(shù)后正常的生活及健康、檢查不會(huì)產(chǎn)生影響[22-24]。

通過對(duì)新材料的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，新型復(fù)合型人工胸壁材料實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好,乳糖-殼聚糖和聚乳糖-聚已內(nèi)脂新型人工胸壁復(fù)合材料具有一定應(yīng)用前景。隨著科技和認(rèn)知的不斷進(jìn)步，人們對(duì)醫(yī)療健康的認(rèn)識(shí)也有了從質(zhì)到量的轉(zhuǎn)變。人們關(guān)注的焦點(diǎn)已不再是局限于疾病的臨床療效結(jié)果，更關(guān)注治療本身帶來的生活質(zhì)量問題。近年來，隨著越來越多人工胸壁復(fù)合材料出現(xiàn)，人工胸壁材料獲得了巨大的發(fā)展，并且隨著3D技術(shù)的普及應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，人工替代材料外科手術(shù)有了個(gè)體化的特點(diǎn)，也使胸壁缺損個(gè)體化修復(fù)成為可能[25-27]。然而，生物醫(yī)用人工胸壁的研發(fā)涉及多學(xué)科領(lǐng)域，僅僅靠一個(gè)團(tuán)體，一個(gè)行業(yè)的努力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要各個(gè)行業(yè)團(tuán)結(jié)協(xié)作，制造出更有益于患者治療的人工材料。