馬璐璐，陳璐，張璐莎，方樂玉，李春曉，張麗媛，楊文杰，王倩怡，王虹

天津中醫(yī)藥大學，天津301617

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，為活血化瘀要藥［1－4］。丹酚酸A（salvianolic acid A，SAA）是丹參中一種主要的水溶性酚酸類化合物，其在心、腦血管病的治療方面具有重要的研究價值［5－8］。研究表明，SAA可以通過抑制血小板活化達到抗凝血的效果［9］，血小板表面過敏毒素C3a受體（anaphylatoxin C3a receptor，C3aR）屬于固有免疫系統(tǒng)中的補體成分，過敏毒素C3a與其關聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體C3aR結合后，促進內皮通透性，募集和激活中性粒細胞，觸發(fā)炎癥反應和血栓形成［10－11］。SAA可以治療臨床缺血性疾病，且可能參與過敏毒素受體C3aR的表達，因此本研究構建體外血小板和中性粒細胞活化模型，通過比濁法、流式細胞術、免疫熒光技術、酶聯(lián)免疫吸附測定法等檢測相關基因和蛋白的表達，探討SAA是否通過調控C3aR的表達抑制血小板活化、聚集、黏附及中性粒細胞脫顆粒治療臨床缺血性疾病，以期為臨床上治療缺血性疾病機制研究提供思路。

1 材料

1.1 動物SD大鼠，SPF級，雄性，40只，體質量200～220 g；C57BL／6小鼠，SPF級，雄性，6～8周，40只；以上動物購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016－0002，飼養(yǎng)于溫度19～25℃，相對濕度40%～60%的環(huán)境下。

1.2 藥物及試劑丹酚酸A（純度＞99%，成都德思特生物技術有限公司，批號：DST180201－008）；阿司匹林腸溶片（Asprin，每片0.1 g，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ27810）；二磷酸腺苷二鈉鹽（adenosine diphosphate，ADP，美國Sigma－Aldrich公司，批號：SLBN0134V）；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：R415）；APC anti－mouse／rat CD62p antibody（美國Biolegend公司，批號：148304）；水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：P1110）；小鼠中性粒細胞提取試劑盒（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：LZS1091）；髓過氧化物酶（myloperoxidase，MPO）試劑盒、彈性蛋白酶（elastase，NE）試劑盒、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）試劑盒、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為：E－BC－K074－S、E－EL－M0444c、E－EL－M0746c、E－EL－M2732c）。

1.3 儀器Flex Station?3酶標儀（美國Molecular Device公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）；64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 血小板懸液的制備采用5%水合氯醛麻醉SD大鼠，腹主動脈取血10 mL，放入盛有ACD（檸檬酸38 mmol·L－1、檸 檬 酸 鈉75 mmol·L－1、葡 萄 糖124 mmol·L－1）的15 mL離心管中搖勻，1 200 r·min－1離心10 min，取上清液，即為富含血小板的血漿（platelet rich plasma，PRP）。PRP在3 000 r·min－1下離心10 min，沉淀部分即為血小板，在血小板改良臺式液（無鈣）中洗兩次，用改良臺式液稀釋成適當濃度，使其吸光度值在1左右，備用。

2.2 中性粒細胞的提取及缺氧模型的制備根據小鼠中性粒細胞提取試劑盒說明書對小鼠外周血中中性粒細胞進行提取。取上述制備好的中性粒細胞，分別與生理鹽水、100μmol·L－1的丹酚酸A及10μmol·L－1的C3aR抑制劑于37℃孵育20 min后，置于缺氧小室中，通入混合氣（1%O2、5%CO2、94%N2），于37℃恒溫培養(yǎng)箱中缺氧處理4 h。在1 000 g下離心20 min，取上清液，即為缺氧誘導的中性粒細胞活化模型，其中常氧組為空白對照組。

2.3 比濁法檢測血小板聚集率取上述制備好的血小板，檢測20μmol·L－1ADP誘導的血小板聚集率以及加入1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1SAA后的聚集率；檢測200 nmol·L－1過敏毒素C3a誘導的血小板聚集率以及加入SAA后的聚集率。用微孔法測血小板聚集率，使用酶標儀檢測405 nm波長處樣品的OD值。

血小板聚集率＝（ODt＝0－ODt＝30）／ODt＝0×100%（30 min內OD值的變化）。

2.4 免疫熒光技術檢測血小板在纖維蛋白原上的黏附準備載玻片，包被50 mg·L－1纖維蛋白原溶液150μL，4℃孵育過夜，PBS洗滌。血小板與生理鹽水、不同濃度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制劑于37℃孵育20 min，ADP誘導10 min，取血小板懸液150μL加到包被有纖維蛋白原的載玻片上，37℃孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗3次，除去多余的多聚甲醛，采用鬼筆環(huán)肽對血小板避光標記20 min，熒光顯微鏡下觀察并隨機選取三個視野拍照，Image J軟件測量血小板面積。

2.5 流式細胞儀檢測血小板膜蛋白CD62p和C3aR的表達取上述制備好的血小板，分別與生理鹽水、不同濃度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制劑于37℃孵育20 min，加20μmol·L－1ADP于37℃孵育10 min，分別加入CD62p－APC和C3aR－FITC抗體，室溫避光孵育30 min，加入500μL 1%多聚甲醛，充分混勻，用流式細胞儀檢測血小板CD62p和C3aR的熒光強度。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測MPO、NE、LF及MMP9的水平嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作檢測MPO、NE、LF及MMP9的水平。

2.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差齊組間兩兩比較采用LSD－t檢驗；方差不齊組間兩兩比較采用Dunnett－T3檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度的丹酚酸A抑制ADP誘導的血小板聚集、黏附和釋放利用ADP處理血小板構建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經ADP處理后血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達顯著增高（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；與ADP誘導組相比，不同濃度SAA處理組和阿司匹林陽性對照組血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達顯著降低（P＜0.05）。提示不同濃度的SAA可抑制ADP誘導的血小板聚集、黏附和釋放。見圖1。

圖1 不同濃度SAA對ADP誘導的大鼠血小板聚集、黏附和釋放的影響

3.2 C3aR介導參與血小板聚集、黏附和釋放利用ADP處理血小板構建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經ADP處理后血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附和CD62p表達顯著增高（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）；與ADP誘導組比較，C3aR抑制劑處理組血小板的聚集、與纖維蛋白原的黏附及CD62p表達顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05）。提示C3aR參與機體血小板的活化過程。見圖2。

3.3 SAA抑制C3aR表達發(fā)揮抗血小板作用利用ADP處理血小板構建體外血小板活化模型，與生理鹽水組比較，經ADP處理后的血小板C3aR表達水平顯著增高（P＜0.05）；與ADP誘導組比較，不同濃度的SAA處理組血小板的C3aR表達水平顯著降低（P＜0.05）。利用C3a處理血小板構建體外血小板活化模型，與未處理組比較，經C3a處理后的血小板聚集水平顯著增高（P＜0.05）；與C3a誘導組比較，不同濃度的SAA處理組血小板的聚集水平顯著降低（P＜0.05）。提示不同濃度的SAA抑制C3aR的表達發(fā)揮抗血小板作用。見圖3。

圖2 C3aR對ADP誘導大鼠血小板活化、聚集和黏附的影響

圖3 SAA抑制C3aR表達發(fā)揮抗血小板作用

3.4 SAA對缺氧誘導的中性粒細胞脫顆粒的抑制作用利用1%O2處理中性粒細胞構建體外中性粒細胞活化模型，與常氧組比較，經1%O2處理后中性粒細胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著增高（P＜0.05）；與缺氧誘導組比較，SAA處理組中性粒細胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

3.5 C3aR介導參與中性粒細胞脫顆粒利用1%O2處理中性粒細胞構建體外中性粒細胞活化模型，與常氧組比較，經1%O2處理后中性粒細胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著增高（P＜0.05）；與缺氧誘導組比較，C3aR抑制劑處理組中性粒細胞的MPO、NE、MMP9、LF水平顯著降低（P＜0.05）。提示中性粒細胞活化可能與過敏毒素受體C3aR有關。見圖5。

圖4 SAA對缺氧誘導小鼠中性粒細胞脫顆粒的影響

圖5 C3aR對缺氧誘導小鼠中性粒細胞脫顆粒的影響

4 討論

血小板和中性粒細胞在維持血管和組織完整性方面起著至關重要的作用。血小板和巨核細胞通過胞外介質和微粒與中性粒細胞相互作用，增強中性粒細胞的激活作用［12－17］。激活的中性粒細胞表達組織因子，與血小板相互作用時促進免疫血栓形成［18－19］。血小板－中性粒細胞的相互作用對心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定有顯著影響，被認為是治療心血管疾病的方向［20－21］。補體作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，激活后會放大和促進中性粒細胞和血小板的激活［22］。本研究分別針對血小板激活和中性粒細胞脫顆粒對丹酚酸A的免疫調節(jié)進行評價。ADP是體外導致血小板活化的常見誘因，缺氧誘導的中性粒細胞脫顆粒反應是中性粒細胞發(fā)揮免疫效應的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，ADP導致血小板活化，并引起固有免疫反應，缺氧導致中性粒細胞活化，發(fā)生脫顆粒反應；而丹酚酸A預孵育可以抑制補體成分過敏毒素受體C3aR表達，從而抑制血小板活化和中性粒細胞脫顆粒，發(fā)揮免疫學效應。

血小板是巨核細胞釋放的無核細胞碎片，經過一個多階段的細胞質分裂過程，在數(shù)天內將生物活性化合物濃縮成顆粒，以細長的前體形式釋放，這些前體經歷多次反復裂變達到最終大?。?3］。血小板內含有多種顆粒成分，在發(fā)揮止血功能時可以釋放生物活性介質［24］，且在機體防御入侵病原體方面發(fā)揮重要作用。血小板在血管損傷時通過其表面免疫受體的表達和分泌炎癥調節(jié)因子、免疫調節(jié)因子，識別并控制侵入的病原體，釋放刺激物促進組織修復，發(fā)揮免疫效應［25－26］。血小板表面免疫受體C3aR屬于固有免疫系統(tǒng)中的補體系統(tǒng)，在感染或組織應激時補體激活，產生一組具有不同生物學功能的效應分子［27－28］，小片段C3a通過與其特定受體C3aR相互作用介導炎癥。雖然過敏性毒素受體C3aR通常與炎癥細胞相關，但體外研究表明它們也在血小板上表達［29］。血小板是具有高度免疫活性的細胞，通過補體系統(tǒng)的激活，可以在血管炎癥過程中協(xié)調動脈粥樣硬化形成中的初始信號事件［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，C3aR抑制劑可以顯著抑制ADP誘導的血小板活化；丹酚酸A不僅可顯著抑制ADP誘導的血小板活化，還能下調C3aR的表達。推測丹酚酸A可通過調節(jié)C3aR的表達抑制血小板的活化，C3aR是調節(jié)血小板活化途徑的重要蛋白。

中性粒細胞構成血液中最豐富的白細胞群體，對有害刺激的病原體進行早期先天免疫反應［31］。中性粒細胞表達大量的氧化酶和蛋白水解酶，這些酶預先形成并儲存在顆粒中。中性粒細胞損傷周圍組織的傾向與其激活狀態(tài)密切相關，增強脫顆粒和呼吸爆發(fā)活動的啟動是造成重大損害的先決條件。缺氧顯著上調了中性粒細胞主要顆粒的釋放，在一定程度上促進了內皮細胞損傷［32］。中性粒細胞在刺激后更容易受到C3a／C3aR的激活，發(fā)生脫顆粒反應［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起中性粒細胞脫顆粒，增加NE、MPO、MMP9、LF的釋放；丹酚酸A可以顯著抑制中性粒細胞中NE、MPO、MMP9、LF的水平；而C3aR抑制劑可以顯著抑制缺氧誘導的中性粒細胞脫顆粒。推測丹酚酸A可通過調節(jié)C3aR的表達抑制中性粒細胞的活化。

綜上所述，丹酚酸A可能通過調控C3aR的表達抑制血小板聚集、黏附和釋放，防止中性粒細胞脫顆粒，從而預防和治療臨床缺血性疾病。