王夢(mèng)雨，王 超，朱洲均，石 沖，向 偉，王 堆，邱貞宇，史晨輝，王維山*

1.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子832000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種受生物力學(xué)與生物化學(xué)共同影響的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，是成年人常見的肌肉骨骼疾病。據(jù)估計(jì)，到2040 年將有7 800萬人患骨關(guān)節(jié)炎[1]，導(dǎo)致殘疾和生活質(zhì)量下降。關(guān)節(jié)疼痛是骨性關(guān)節(jié)炎的明確癥狀，但其病因尚不清楚[2]。OA 的發(fā)生與遺傳、年齡、性別、體重、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和異常機(jī)械負(fù)荷等因素有關(guān)[3]。OA 病變主要包括關(guān)節(jié)軟骨退變鈣化、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨下囊腫、軟骨下骨重塑、硬化、血管侵襲以及骨軟骨界面滲透性增加[4-5]。OA 與民族、性別、體重、年齡、遺傳、飲食、生活方式及生活環(huán)境等密切相關(guān)，不同國家、地區(qū)、民族其患病率及影響因素均不相同。軟骨下骨血管生成增多，血管突破基底進(jìn)入無血管軟骨，是骨關(guān)節(jié)炎的診斷特征。Xu 等[6]研究證明來源于破骨細(xì)胞的PDGF-BB 是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中病理軟骨下骨血管生成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

本研究分析新疆地區(qū)人群原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎(primary knee osteoarthritis，PKOA)的PDGF-BB 基因型，旨在探討新疆地區(qū)漢族、維吾爾族人群基因型頻率分布，為其與原發(fā)性O(shè)A 等相關(guān)的研究提供依據(jù)，從基因角度探討原發(fā)性O(shè)A 發(fā)病的遺傳易感因素。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2019 年1 月至2020 年11 月石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院、農(nóng)三師醫(yī)院、圖木舒克市人民醫(yī)院PKOA 漢族患者80 例，其中男性28 例，女性52例(年齡48～81 a，平均年齡56.66 a)，正常對(duì)照組186 例(年齡41～74 a，平均年齡55.61 a)，男性78例，女性108 例；維吾爾族PKOA 患者91 例，其中男性42 例，女性49 例(年齡41～72 a，平均年齡56.82 a)，正常對(duì)照組162 例，男性63 例，女性99例(年齡40～78 a，平均年齡54.30 a)。所選取的研究對(duì)象均為長(zhǎng)期生活在新疆地區(qū)的人群。

1.2 主要儀器與試劑

PCR 熱循環(huán)儀(Eppendorf Master-cycle gradient，Germany)，低溫高速離心機(jī)(HerauesD-37520，Germany)，F(xiàn)-90 型多功能暗箱紫外透射儀，DNA 試劑提取盒(北京天根生化公司)，瓊脂糖，rs1800817、rs2285094 Pcr 上下游引物。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

住院或在門診取病人的外周血2 ml，存放于EDTA 管中；農(nóng)三師和圖木舒克的樣本根據(jù)病人信息在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢驗(yàn)科中收集。將所收集的樣本放置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.2 DNA 的提取

采用全血DNA 基因提取盒，按照操作步驟提取DNA，將提取出的DNA 至于1.5 ml 凍存管中，并在紫外線分度儀下測(cè)出提取的DNA 濃度，將濃度合格的DNA 樣本至于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

使用上海生工生物有限公司的軟件設(shè)計(jì)PDGFBB 的rs1800817 位點(diǎn)上游引物CGC TCT TCC TGT CTC TCT GC；下游引物GTT CTC GGG TTC CCA AAG GG。rs2285094 位點(diǎn)的上游引物CCA TGT GCT GAC CAC TTC AT；下游引物GCC ACA TAA CAG GTC TGG CT。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增

使用移液槍將解凍好的DNA 吸出3 μl、rs2285094 位點(diǎn)上及下游引物各1 μl、PCR mix10μl、無酶水5 μl 至離心管中組成共20 μl 的反應(yīng)體系(見表1)；將PCR 管放入96 孔的梯度PCR 儀里之后再設(shè)定PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：①預(yù)變性94 ℃5 min②變性94 ℃30 min ③退火62 ℃30 min ④延伸72 ℃27 min ⑤重復(fù)延伸72 ℃5 min ⑥取出反應(yīng)體系標(biāo)記并放入-20 ℃冰箱中備用。用相同的方法進(jìn)行rs1800817 位點(diǎn)DNA 擴(kuò)增。

表1 PCR 反應(yīng)體系

1.3.5 凝膠電泳及成像

用微量加樣槍吸出6 μl DNA maker 加入凝膠的第一個(gè)孔中，再取4 μl DNA 與DNA 上樣緩沖液(loading buffer1 μl)的混合液加入其他凝膠孔內(nèi)并做好記錄。將完成加樣的凝膠平放在水平電泳儀的電泳板上，向電泳板內(nèi)加入TBE 溶液進(jìn)行電泳。電泳參數(shù)：電壓100～120 V；電泳時(shí)間：35 min。在電泳結(jié)束后，將電泳凝膠取出放在成像儀內(nèi)，通過調(diào)整凝膠塊位置合適后進(jìn)行曝光，將曝光后的圖像保存并記錄。

1.3.6 DNA 測(cè)序

將經(jīng)過凝膠電泳過并通過凝膠成像系統(tǒng)確認(rèn)PCR 成功后的DNA 樣本標(biāo)號(hào)記錄，送至博邁德(北京)基因技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA 雙向測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)樣本人群的年齡、身高、體重等計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料采用ˉx±s 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，對(duì)分類資料如性別、是否吸煙、是否飲酒等采用n(%)表示；采用哈迪-溫伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium)方法對(duì)基因位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行檢驗(yàn)；對(duì)兩組間計(jì)量資料的比較采用t 檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)；應(yīng)用 二分類logistic回歸模型對(duì)患PKOA 的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。其中以P＜0.05 作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基線資料比較

分別對(duì)新疆地區(qū)的漢族與維吾爾族膝骨性關(guān)節(jié)炎組與非膝骨性關(guān)節(jié)炎組的年齡、身高、體重、BMI、性別、是否抽煙、是否喝酒(見表2)進(jìn)行比較，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。性別、是否吸煙、是否飲酒、是否從事重體力勞動(dòng)進(jìn)行比較，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表2。

表2 一般資料

2.2 PCR 和基因測(cè)序結(jié)果

將所提取的漢族PKOA 組和對(duì)照組、維吾爾族PKOA 組和對(duì)照組的DNA 分別加入PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)引物、rs2285094 位點(diǎn)的引物在PCR儀中擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的DNA 行2%瓊脂糖凝膠電泳。將擴(kuò)增結(jié)果滿意的DNA 送至北京博邁德基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序，分析受試者的 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因型。比較SNP中的rs1800817 位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)中的rs1800817 位點(diǎn)，有GT、GG 兩種基因型；比較SNP 中的rs2285094 位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)中的rs2285094 位點(diǎn)，有CT、CC 兩種基因型。

2.3 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性與維吾爾族PKOA 的相關(guān)性

維吾爾族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點(diǎn)的CC型、CT型分布不同(χ2=17.9，P＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)的GT 型、GG 型分布不同(χ2=5.08，P＜0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。說明維吾爾族攜帶rs2285094和rs1800817 位點(diǎn)的CC 型、CT 型的個(gè)體患原發(fā)性PKOA 有相關(guān)性。

表3 維吾爾族PKOA 與對(duì)照組的基因型分布

2.4 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性與漢族PKOA 的相關(guān)性

漢族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點(diǎn)的CC型、CT 型分布(χ2=0.001，P=0.98)與非PKOA 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)的GT型、GG 型分布(χ2=4.61，P=0.032)與非PKOA 組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表4。說明漢族攜帶rs1800817 位點(diǎn)的CC 型、CT 型的個(gè)體患PKOA 有相關(guān)性；而與攜帶rs2285094 無相關(guān)性。

表4 漢族PKOA 與對(duì)照組的基因型分布

2.5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

經(jīng)多因素Logistic 回歸分析，年齡、民族、rs1800817位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性是OA 的危險(xiǎn)因素；其中民族是PKOA 的危險(xiǎn)因素，這可能與不同民族間的生活方式及飲食不同有關(guān)，性別、BMI、抽煙、飲酒、從事重體力勞動(dòng)不是OA 的危險(xiǎn)因素。見表5。

表5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

OA 是全球最常見的關(guān)節(jié)疾病，60 a 以上的男性約有10%，女性約有18%[5-6]。較大的體重、反復(fù)外傷或手術(shù)聯(lián)合結(jié)構(gòu)、出生時(shí)關(guān)節(jié)異常、痛風(fēng)、糖尿病以及與荷爾蒙相關(guān)的疾病等，已經(jīng)被證明為OA[7-8]的風(fēng)險(xiǎn)增加，其特征是進(jìn)行性退化的關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變，骨贅形成和滑膜炎癥[9-11]。此外，血管生成在組織修復(fù)和骨性關(guān)節(jié)炎的病理生理中起著重要作用[12]。但目前治療骨關(guān)節(jié)炎尚未有有效的疾病調(diào)節(jié)劑，Walsh 和Mapp 等研究表明骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)的血管生成，即從已有的血管中生成新血管，是已知的促進(jìn)OA 進(jìn)展的因素[13-14]。特別是軟骨下異常的骨血管生成導(dǎo)致血管系統(tǒng)入侵骨軟骨連接是人類骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)標(biāo)志[15]。有研究表明PDGF-BB 的基因多樣性與金屬裸支架術(shù)后再狹窄有一定的關(guān)系[16]。Arora-Singh和Gourh 在研究中發(fā)現(xiàn)PDGF-BB 中的rs2285094位點(diǎn)基因多樣性與硬皮病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。[17-18]近年來Su 等[19]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)PDGFBB 異常增加，誘導(dǎo)軟骨下骨血管生成，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

綜上所述，PDGF-BB 與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。PDGF-BB 基因多樣性與許多疾病都有著密切關(guān)系，但PDGF-BB 基因多樣性與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系以往無相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)通過病例對(duì)照研究，使用卡方檢驗(yàn)、多因素logistic 回歸等方法，分析了PDGFBB的rs1800817位點(diǎn)、rs2285094位點(diǎn)多樣性與新疆地區(qū)漢族和維吾爾族膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表示，rs1800817 位點(diǎn)基因型分布在漢族和維吾爾族中均有差異(χ2=5.08，P=0.024；χ2=4.61，P=0.032)；rs228509 位點(diǎn)基因型分布在漢族中無差異(χ2=0.01，P=0.98)；rs2285094 位點(diǎn)基因型分布在維吾爾族中有明顯差異(χ2=17.79，P=0.00)。通過多因素logistic 回歸分析，年齡是骨性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素(OR=1.007)，民族是骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)因素，這可能是維吾爾族與漢族的生活習(xí)慣不同所造成的，這與沈明球等人的流行病學(xué)研究所一致[20]。rs2285094 位點(diǎn)中的CC型和CT 型是骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)因素(OR=0.011)，這提示rs2285094 位點(diǎn)中的CC 型和CT 型攜帶者可能會(huì)減低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但該位點(diǎn)的基因型分布在漢族人群中的分布無差異(χ2=0.01，P=0.98)；rs1800817 位點(diǎn)中的GT 型和GG 型是骨性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素，這提示rs1800817 位點(diǎn)中的GT 型和GG 型攜帶者可能會(huì)增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這可能與本研究樣本量較小有關(guān)，限制了相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)功效，存在一定局限性。此外，PDGF-BB基因多態(tài)性對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎易感性可能為原發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療提供依據(jù)，因此有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。