段杰秋， 孫大寬， 向建英， 唐軍榮

(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院, 云南 昆明 650224)

巢蕨(Aspleniumnidus)又稱鳥巢蕨，是鐵角蕨科(Aspleniaceae)鐵角蕨屬(Asplenium)多年生常綠陰生草本觀葉蕨類植物。巢蕨喜溫暖陰濕環(huán)境，常附生于雨林中的樹干或林下巖石上，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國海南、臺(tái)灣、廣西以及云南等地的原始叢林中也有分布[1]。巢蕨葉形優(yōu)美，具獨(dú)特觀賞價(jià)值，是優(yōu)良的園林景觀和室內(nèi)裝飾植物[2-3]；整株入藥，有強(qiáng)健筋骨、通活瘀血的功效，主要用于外傷、骨折、陽萎、頭痛等癥的治療[4-5]；嫩葉富含礦質(zhì)元素，在臺(tái)灣花蓮地區(qū)作為野生蔬菜食用，是一種新型食用的功能性野生蔬菜[6]。由于巢蕨孢子在自然條件下不易萌發(fā)，加之園林綠化應(yīng)用上的普及和野生資源的采挖破壞，使得該物種野生資源數(shù)量急劇下降[7]。為保護(hù)巢蕨野生資源，同時(shí)滿足市場需求，需加強(qiáng)巢蕨繁育研究。

巢蕨傳統(tǒng)的繁殖方式主要有分株繁殖、孢子播種和組織培養(yǎng)，但傳統(tǒng)的分株繁殖和孢子播種受制約因素多且繁殖率低[8]。采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)材料進(jìn)行繁殖，具有繁殖速度快、不受季節(jié)限制等諸多優(yōu)勢。目前巢蕨的組織培養(yǎng)研究已有零星報(bào)道，使用的外植體包括孢子[9-10]、嫩葉[11]等。但是在植物組織培養(yǎng)過程中，即使同一物種，由于基因型的差異，對(duì)組培快繁的配方也會(huì)存在不同程度的差別[12-14]?；诖?，本研究以巢蕨成熟孢子為外植體，對(duì)影響巢蕨離體繁殖的因素及成苗途徑進(jìn)行了研究，最終建立了試管內(nèi)和試管外兩種離體快繁成苗途徑。研究結(jié)果為巢蕨組培快繁配方的選擇提供了新的參考，也為快繁成苗途徑的選擇和使用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

巢蕨種植于西南林業(yè)大學(xué)溫室大棚，待其孢子成熟時(shí)，收集孢子作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒

用電子天平稱取上述成熟孢子0.05 g，將其置于容量為1.5 mL的離心管中。在無菌環(huán)境下，向離心管中注入濃度為0.1%的升汞溶液，并完全沒過孢子，消毒8 min后進(jìn)行離心。用滴管吸出上層液和孢子囊殼，再用無菌水清洗3～5次后，將其稀釋成0.05 g·mL-1孢子懸濁液，備用。

1.2.2孢子萌發(fā)動(dòng)態(tài)觀測

將孢子懸濁液分別接種到MS、1/2 MS和1/4 MS培養(yǎng)基上，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1瓊脂，pH=5.8。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)培養(yǎng)基接種1 mL懸濁液。定期觀察拍照，培養(yǎng)第18天時(shí)統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率(將培養(yǎng)基置于顯微鏡同一倍鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)各選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的孢子萌發(fā)率，其均值即為該處理孢子萌發(fā)率)。

1.2.3配子體增殖配方篩選

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1瓊脂，pH=5.8。采用正交試驗(yàn)法將6-BA與NAA以不同濃度配比(表1)添加到培養(yǎng)基中。試驗(yàn)選取孢子萌發(fā)后形成的配子體團(tuán)(直徑約0.8 cm)，平鋪接于培養(yǎng)基中。試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理，3次重復(fù)。培養(yǎng)過程定期觀察配子體生長情況，60 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

1.2.4試管內(nèi)成苗途徑

1) 配子體誘導(dǎo)成苗。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1瓊脂，pH=5.8。將增殖得到的配子體團(tuán)平鋪轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)過程中延長配子體培養(yǎng)時(shí)間(對(duì)照)、添加適量無菌水和液體1/2 MS ，并定期適當(dāng)搖晃。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，3次重復(fù)，培養(yǎng)過程定期觀察誘導(dǎo)情況。

2) 誘導(dǎo)GGB快繁成苗。將1) 中獲得的部分小苗，分別轉(zhuǎn)接至MS+6-BA 1 mg·L-1、MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1及1/2 MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1三種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，附加30g·L-1蔗糖，4 g·L-1瓊脂，pH=5.8。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，各含30株小苗，3次重復(fù)，培養(yǎng) 60 d后統(tǒng)計(jì)GGB誘導(dǎo)情況。

3) 小苗生根。以獲得的小苗為材料，分別轉(zhuǎn)接至含有IBA(0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)的 1/2 MS培養(yǎng)基中，附加30 g·L-1蔗糖，4 g·L-1瓊脂，pH=5.8。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，各含10株小苗，3次重復(fù)，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)小苗生根情況。

1.2.5試管外成苗途徑

試驗(yàn)選取“泥炭蘚”和“泥炭蘚∶蛭石=2∶1”兩種栽培基質(zhì)，將增殖得到的配子體瓶苗移至室內(nèi)自然光下適應(yīng)7 d后，將其切成直徑約為0.8 cm的小塊，均勻移栽入上述基質(zhì)中，澆水覆蓋保濕。培養(yǎng)過程中，分別為兩種基質(zhì)噴施冷開水和1 g·L-1的 KH2PO4。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，各處理約含200個(gè)配子體，3次重復(fù)，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)成苗情況。

1.2.6培養(yǎng)條件

試驗(yàn)均在室溫(25±2)℃，光照2 000 lx，光周期為12 h·d-1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0、Excel 2007等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子萌發(fā)情況

接種在 MS、1/2 MS和1/4 MS培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)率不同。由表2可知，巢蕨孢子在3種培養(yǎng)基上都可以萌發(fā)，但不同處理間萌發(fā)率差異顯著，孢子在1/4 MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)效果最好，萌發(fā)率高達(dá)91.75%。3種不同濃度MS培養(yǎng)基中，隨著無機(jī)鹽濃度降低，萌發(fā)率升高，可見低無機(jī)鹽濃度有助于巢蕨孢子萌發(fā)。孢子萌發(fā)動(dòng)態(tài)見圖1，其中，巢蕨孢子接種約1周后開始萌發(fā)，即分裂出初生假根和原始細(xì)胞(圖1-a)；接種約2周時(shí)處于絲狀體時(shí)期(圖1-b)；3周則處于片狀體時(shí)期(圖1-c)；接種1個(gè)月后逐漸長成配子體(圖1-d)。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different basic media on spore germination

2.2 配子體增殖配方篩選

不同配方處理的配子體增殖系數(shù)和生長狀況存在差別。由表3可知，9個(gè)處理的增殖系數(shù)均達(dá)到4倍及以上，可見巢蕨配子體增殖過程對(duì)培養(yǎng)基激素配方適應(yīng)性較廣。但B1、B2、B3和B7處理的增殖系數(shù)較高，且生長狀況較好，其中 B7處理的增殖系數(shù)最高，且配子體生長狀態(tài)最好。綜上，B7處理(6-BA 0.3 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1)是巢蕨配子體增殖的最適激素組合(圖2-a)。

2.3 試管內(nèi)成苗途徑

2.3.1配子體誘導(dǎo)成苗

在增殖培養(yǎng)獲得大量的配子體后，進(jìn)行配子體誘導(dǎo)成苗。由于在前期采用表3的配方進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)后，配子體未能正常成苗，因此，增加了使用不同誘導(dǎo)劑對(duì)配子體進(jìn)行處理的成苗試驗(yàn)，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，對(duì)照處理在經(jīng)過較長時(shí)間培養(yǎng)后也能長出小苗，但C1、C2處理的配子體成苗時(shí)間和成苗率都明顯優(yōu)于對(duì)照組，C1、C2處理的成苗效果無顯著差異(圖2-b)。由此可見，配子體在試管內(nèi)經(jīng)長時(shí)間培養(yǎng)后也能成苗，但添加液體誘導(dǎo)劑有助于配子體成苗。

表3 不同激素組合對(duì)配子體增殖的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on gametophyte proliferation

表4 不同處理的配子體成苗情況

2.3.2GGB誘導(dǎo)及快速增殖

為了使獲得的小苗快速增殖，以上節(jié)中獲得的小苗為材料進(jìn)行GGB的誘導(dǎo)。由表5可知，3種培養(yǎng)基配方D1、D3與D2的誘導(dǎo)結(jié)果間存在顯著差異。D2處理的GGB誘導(dǎo)率達(dá)94.33%，GGB增殖效果明顯優(yōu)于D1和D3處理，且GGB長勢較好、易分化出叢生苗(圖3-bc)。綜上，D2處理(MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1)最適合誘導(dǎo)GGB。

表5 不同處理的GGB誘導(dǎo)及增殖情況

2.3.3小苗生根

將獲得的小苗轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基中，生根效果和生長狀態(tài)存在差異。由表6可知，對(duì)照組處理的小苗，生根率最低、生根數(shù)量較少且后期小苗生長狀態(tài)不佳；E1、E3與E2處理的生根結(jié)果間無顯著差異。其中E2處理(IBA 1 mg·L-1)的生根情況最好(圖4)，小苗均能生根，根多且粗長，小苗整體生長健壯，生根后按常規(guī)移栽煉苗管理容易成活。

表6 不同處理的小苗生根情況Table 6 Rooting condition of seedlings with different treatments

2.4 試管外誘導(dǎo)成苗

由表7可知，不同處理的配子體試管外誘導(dǎo)成苗結(jié)果差異顯著。其中，F(xiàn)2與F4處理的小苗誘導(dǎo)率顯著高于其他處理，且小苗顏色鮮綠、長勢較好(圖5-bd)。由此可見，噴灑1 g·L-1的 KH2PO4溶液，能明顯促進(jìn)配子體試管外成苗。待小苗生長穩(wěn)定后，將其進(jìn)行定植，定植后60 d時(shí)，小苗顏色鮮綠，長勢較好(圖6-a)；定植后第100天時(shí)，長勢最好的小苗株高11.8 cm，葉寬1.4 cm，且顏色呈現(xiàn)深綠色，生長健壯(圖6-b)。綜上，兩種栽培基質(zhì)對(duì)配子體成苗影響無差異，但KH2PO4溶液能有效促進(jìn)配子體試管外成苗。

表7 不同處理的配子體成苗情況Table 7 Comparison of seedling formation by gametophyte in different treatments

3 結(jié)論與討論

巢蕨繁殖主要靠孢子，但普通條件下難以萌發(fā)，即使是人工進(jìn)行播種，其繁殖周期也較長，孢子萌發(fā)率低，不易出苗，因而難以被生產(chǎn)采用[15]。但通過組織培養(yǎng)的方式則能夠?qū)崿F(xiàn)在較短時(shí)間內(nèi)獲取大量種苗的目標(biāo)，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。在蕨類植物組織培養(yǎng)過程中，除了某些孢子具有休眠特性的物種外，通常情況下孢子在接種后2～5周萌發(fā)。有研究指出，巣蕨孢子在接種1個(gè)月左右萌發(fā)，即肉眼可見綠色小點(diǎn)[9,16]。而本試驗(yàn)利用顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)巣蕨孢子接種約1周后開始萌發(fā)(分裂出初生假根和原始細(xì)胞)，2～3周內(nèi)則逐漸從絲狀體向片狀體轉(zhuǎn)變，接種1個(gè)月后逐漸生長為成熟配子體。一般情況下，蕨類孢子類似于種子植物的種子，體內(nèi)存儲(chǔ)的營養(yǎng)物質(zhì)能提供早期萌發(fā)需要[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，巢蕨孢子隨著無機(jī)鹽濃度降低，萌發(fā)率會(huì)呈遞增趨勢，高濃度無機(jī)鹽會(huì)抑制巢蕨孢子的萌發(fā)。這可能是因加入無機(jī)鹽后，培養(yǎng)基的滲透勢較高，延遲了孢子外壁破裂的時(shí)間，從而抑制假根和原葉體細(xì)胞的發(fā)育[18]。但也有研究認(rèn)為，全量MS培養(yǎng)基最適于孢子萌發(fā)[19-20]。例如，在水蕨孢子萌發(fā)中，隨著培養(yǎng)基成分的降低，水蕨孢子萌發(fā)率呈遞減的趨勢[21]?？梢姴煌锓N的蕨類植物在無菌培養(yǎng)中，對(duì)培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度的要求不同。本研究得出低無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基有助于巢蕨孢子萌發(fā)。

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)中起著重要的作用。在巢蕨的離體培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑也發(fā)揮重要的作用，適宜濃度的激素如 NAA、6-BA 和2,4-D 等對(duì)巢蕨配子體的增殖分化有良好的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中，6-BA濃度為0.3 mg·L-1、NAA 濃度為 0.2 mg·L-1處理的配子體，增殖系數(shù)最高，且配子體在9個(gè)不同激素濃度配比的培養(yǎng)基中，增殖倍數(shù)都達(dá)到4倍及以上。由此可見，巢蕨配子體增殖過程對(duì)培養(yǎng)基激素配方適應(yīng)性較廣。此外，對(duì)于配子體成苗，有研究發(fā)現(xiàn)，巢蕨無菌播種產(chǎn)生的配子體，在固體培養(yǎng)基上未能直接誘導(dǎo)出小苗，提出巢蕨誘導(dǎo)成苗有賴于水作為媒介[16，22]。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果，通過增加繼代次數(shù)并延長培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)添加誘導(dǎo)劑作為媒介，可以促進(jìn)巢蕨的配子成苗。但也有研究者將巢蕨配子體團(tuán)轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d后分化出小苗[23]，與本試驗(yàn)前期難以誘導(dǎo)成苗的結(jié)果不同。因而可猜想在植物組織培養(yǎng)過程中，即使同一物種，也有可能會(huì)因?yàn)榛蛐?、外植體類型、年齡以及培養(yǎng)基中的激素存在差異，而導(dǎo)致植株再生能力和組培快繁的效果存在不同程度的差別[12-14]。由此，可進(jìn)一步探討基因型對(duì)組培植株再生能力的影響，需要進(jìn)一步的分子證據(jù)來揭示其作用機(jī)制。

在巢蕨試管內(nèi)成苗中，配子體難以轉(zhuǎn)化為小苗，通過添加誘導(dǎo)劑的方式能誘導(dǎo)出小苗，但成苗率極低。此時(shí)，再以誘導(dǎo)出的小苗為材料，進(jìn)行GGB的誘導(dǎo)，可實(shí)現(xiàn)巢蕨小苗的快速增殖。這表明GGB方式是實(shí)現(xiàn)巢蕨試管內(nèi)小苗快速增殖的理想途徑。但是GGB誘導(dǎo)后的小苗，還需要經(jīng)過生根和移栽煉苗，這相對(duì)于配子體試管外成苗而言所需要的成本更高。試管外成苗所需時(shí)間短且成本低，但在管護(hù)時(shí)要特別注意控溫控濕，否則極易造成配子體死亡。因此，在巢蕨快繁時(shí)，選用何種途徑進(jìn)行工廠化育苗，可根據(jù)自身特點(diǎn)進(jìn)行綜合考慮。本研究建立的2種巢蕨快速育苗途徑，為巢蕨的種苗工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐，有助于巢蕨的種質(zhì)資源保護(hù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。