石家莊市中醫(yī)院脾胃科

孟 萍 南月敏△(石家莊 050051)

提要 目的：研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中的表達(dá)，以闡明益氣活血方抑制肝纖維化的分子機(jī)制。方法：27只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和益氣活血方治療組。模型組以30%CCl4 橄欖油溶液腹腔注射誘導(dǎo)建立肝纖維化模型；益氣活血方治療組在CCl4 建模的同時(shí)以益氣活血方灌胃進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)；對(duì)照組腹腔注射橄欖油溶液。檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平；分別采用RT-PCR及Western Blot法檢測(cè)大鼠肝組織JNK信號(hào)通路中JNK、c-Jun mRNA表達(dá)及其磷酸化產(chǎn)物p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠血清ALT、AST水平、肝組織JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)增高，與對(duì)照組相比差異有顯著性，而益氣活血方治療組可顯著降低ALT、AST、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)水平(P均<0.05)。結(jié)論：益氣活血方通過(guò)抑制JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而延緩肝纖維化進(jìn)展。

肝纖維化是肌體對(duì)慢性損傷的主動(dòng)修復(fù)反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積為特征。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員，研究證實(shí)，JNK信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，益氣活血方可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬，抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化及ECM沉積，促進(jìn)膠原降解，并能抑制死亡受體途徑FasL/Fas的激活，上調(diào)線粒體途徑Bcl-2/Bax比例，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮阻止及延緩肝纖維化的作用，但其對(duì)JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響尚不十分清楚。筆者以CCl4建立大鼠肝纖維化模型，并應(yīng)用益氣活血方進(jìn)行治療研究，觀察JNK信號(hào)通路因子的表達(dá)變化，為益氣活血方在臨床應(yīng)用于抗肝纖維化的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠27只，體質(zhì)量180～220 g，來(lái)源于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為3組：對(duì)照組9只，腹腔注射橄欖油(0.2 mL/100 g)，2次/周，并以生理鹽水灌胃(1 mL/100 g)，1次/d；模型組9只，腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，同樣以生理鹽水灌胃；益氣活血方治療組9只，腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，以自擬益氣活血方(黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金等)免煎顆粒劑溶液(免煎顆粒由江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司提供)灌胃。喂養(yǎng)8周后深度麻醉下處死大鼠，留取血清，備行肝臟生化檢測(cè)；剖腹取肝臟，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于提取mRNA及蛋白。

1.2 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用邁瑞B(yǎng)S-800M全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

1.3 肝組織JNK通路因子JNK、c-jun mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法。Trizol一步法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以適量cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。每個(gè)基因重復(fù)操作3次，運(yùn)用2-△△CT法分析結(jié)果。依據(jù)Genbank設(shè)計(jì)引物序列，由上海生物工程公司合成，具體序列詳見(jiàn)表1。

表1

1.4 肝組織JNK通路因子JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá) 取肝組織20 mg，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與兔抗GAPDH(美國(guó)Affinity公司)、兔抗JNK、p-JNK、p-c-Jun抗體(英國(guó)Abcam公司)反應(yīng)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后加入第二抗體，室溫孵育1 h再洗膜。使用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，X光片顯影。應(yīng)用Quantity One軟件分析目的蛋白條帶灰度值，所測(cè)結(jié)果為扣除背景的積分光密度。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對(duì)大鼠血清ALT、AST水平的影響 如表2所示，模型組大鼠血清ALT、AST水平均較對(duì)照組顯著增高(P均<0.001)；益氣活血方治療組大鼠血清ALT、AST水平均明顯低于模型組(P均<0.001)，差異具有非常顯著性。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠血清ALT、AST水平變化

2.2 益氣活血方對(duì)大鼠肝組織JNK信號(hào)通路JNK、c-Jun mRNA表達(dá)水平的影響 如表3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織JNK和c-Jun mRNA表達(dá)水平顯著增加(P分別<0.05，<0.01)；而益氣活血方組c-Jun mRNA水平較模型組明顯下降(P<0.05)，JNK mRNA 2組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織mRNA表達(dá)變化

2.3 益氣活血方對(duì)大鼠肝組織JNK信號(hào)通路JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)水平的影響 如圖1、表4所示，同對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織p-JNK和p-c-Jun蛋白表達(dá)水平顯著增加(P均<0.001)；而益氣活血方組p-JNK、p-c-Jun蛋白水平較模型組明顯下降(P均<0.001)。各組JNK蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)變化

表4 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織蛋白表達(dá)變化

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，伴隨ECM合成增多、降解減少致ECM大量堆積，而HSC是肝纖維組織中ECM的主要來(lái)源[5]。肝纖維化若不及時(shí)治療，將進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量甚至威脅生命。因此，肝纖維化成為預(yù)防和治療肝硬化以及肝癌發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)。

本研究中，CCl4誘導(dǎo)的模型組大鼠血清ALT及AST水平顯著增高。當(dāng)肌體攝入一定量的CCl4，產(chǎn)生大量的親電子基、自由基等活性代謝物，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ALT和AST釋放入血液[6]。而應(yīng)用自擬益氣活血方干預(yù)， ALT及AST水平顯著降低，表明益氣活血方減輕了CCl4對(duì)肝臟的損傷，具有保肝、抗肝損傷的作用。益氣活血方中：⑴黃芪具補(bǔ)氣扶正、固表利水之效，可改善肝組織的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度，抑制肝細(xì)胞凋亡，可有效抗肝損傷[7]；⑵云茯苓和胃健脾、利水滲濕，可改善肝臟的微循環(huán)，抑制ECM的合成[8]；⑶郁金具有活血行氣、涼血解郁、利膽退黃的功效，可降低HSC的膠原蛋白分泌功能，誘導(dǎo)HSC發(fā)生細(xì)胞凋亡[9-10]；⑷丹參和白豆蔻活血化瘀、溫中行氣、化濕健脾，可下調(diào)肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β表達(dá)，抑制ECM合成，起到延緩肝纖維化的作用[11-12]。

JNK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可由3個(gè)基因編碼，分別為JNK1、JNK2及JNK3，可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外刺激信號(hào)致細(xì)胞內(nèi)，多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)控包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等生理活動(dòng)[13]。c-Jun蛋白是JNK蛋白激酶的重要底物，活化的JNK可進(jìn)一步激活c-Jun，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物學(xué)作用[14]。本研究從mRNA及蛋白表達(dá)角度顯示，模型組大鼠肝組織JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，提示JNK活化，并激活c-Jun，可作為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一；而應(yīng)用益氣活血方能顯著抑制c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)的上調(diào)，提示益氣活血方能抑制JNK及其下游c-Jun的激活，進(jìn)而延緩或阻止肝纖維化。研究證實(shí)，多種細(xì)胞因子可通過(guò)JNK信號(hào)通路激活HSC[15]，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，應(yīng)用JNK特異阻斷劑可抑制HSC增殖[16]，有效抗肝纖維化。與作者的結(jié)果相同，中藥芝麻素可抑制受損肝細(xì)胞JNK的表達(dá)，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化，阻止CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[17]。同時(shí)，呂曉梅等[18]證實(shí)CCl4致大鼠急性肝損傷模型中，模型組大鼠肝臟中p-JNK和p-c-Jun蛋白表達(dá)水平顯著增加。然而，李政通等[19]發(fā)現(xiàn)，p-JNK1/2蛋白在肝纖維化模型組較正常組顯著降低，而在肝纖維化逆轉(zhuǎn)期表達(dá)增加，且p-JNK的含量與膠原蛋白主要組分羥脯氨酸(Hyp)的表達(dá)負(fù)相關(guān)，說(shuō)明p-JNK與肝纖維化病變程度呈負(fù)相關(guān)性，與作者的結(jié)果相反，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

研究證實(shí)，肝損傷與JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)，且常伴隨肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]?；罨腏NK可能通過(guò)以下機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。(1)死亡受體途徑：激活下游c-Jun、c-Fos樣轉(zhuǎn)錄因子等，上調(diào)促凋亡蛋白P53、FasL等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]；(2)線粒體途徑：上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，作用于線粒體促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，從而激活胱天蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。

綜上分析，結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，抑制FasL/Fas系統(tǒng)的激活，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2/下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，降低JNK及其下游c-jun的表達(dá)，調(diào)控JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而減少肝細(xì)胞凋亡，可能是益氣活血方減輕CCl4模型大鼠肝細(xì)胞損傷、延緩肝纖維化進(jìn)展的部分作用機(jī)制。